CpG-ODN加強樹突狀細胞疫苗治療小鼠膀胱腫瘤的實驗研究

聶志林,梁培禾,霍文謙,張克勤,靳風爍

(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所泌尿外科,重慶400042)

盡管樹突狀細胞(dendriticcell,DC)疫苗在腫瘤治療中顯示出令人憧憬的前景,但真正為臨床所用,還存在構建方法和質量控制等問題,在DC的分化過程中,其成熟度與功能直接相關。研究證明,含未甲基化CpG基序的細菌DNA或人工合成的寡聚脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotieds,ODN)具有強大的促DC成熟功能[1-2]。本研究利用CpG序列的寡脫氧核糖核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide,CpG-ODN)作為骨髓來源DC的成熟刺激信號,體外誘導DC充分成熟,并將膀胱腫瘤抗原負載于DC,制備 DC疫苗,探討CpG-ODN對 DC疫苗治療小鼠膀胱腫瘤模型作用的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株及實驗動物 BTT739小鼠膀胱腫瘤細胞株,本室保存,T739近交系小鼠48只,中國醫學科學院腫瘤研究所實驗動物中心提供,雌雄各半,5周齡,體質量20～25 g。

1.2 主要試劑 CpG-ODN:ATA ATC GAC GTT CAA GCA AG[3],上海生工生物技術公司合成,兩端均用磷硫酰修飾。FITC-大鼠抗小鼠CD80單克隆抗體、FITC-大鼠抗小鼠CD86單克隆抗體及FITC標記的同型IgG購自美國Promega。

1.3 荷瘤小鼠模型的建立 BT T 739小鼠膀胱腫瘤細胞株常規培養,細胞生長至80%～90%時,臺盼藍染色計數細胞,檢測活細胞比例大于95%,調整細胞數為1×106/mL。將細胞懸液注射于T739小鼠右前腋皮下,每只0.2 mL(2×105個)。

1.4 負載腫瘤抗原的DC疫苗的制備 參照文獻[4-5],制備BTT739腫瘤細胞凍融粗提全抗原,體外沖擊致敏法:收獲培養第7天的DC[2],調整濃度為1×106/mL,常規臺朌藍試驗示活細胞數大于90%;每孔按DC與抗原細胞的比例1∶10(抗原的量以凍融前腫瘤細胞的量計)加入BTT739腫瘤細胞凍融抗原。加入 rmGM-CSF、rmIL-4使其終濃度分別為500 u/mL、200 u/mL,繼續置于37℃,5%CO2飽和濕度孵箱中培養48 h,加入CpG-ODN使其終濃度分別為2 μ mol/L,繼續培養48 h后收獲DC細胞即得DC疫苗。

表1 不同治療組荷瘤小鼠皮下腫瘤體積變化情況(cm3)

1.5 實驗分組 T739小鼠48只,接種腫瘤細胞 7 d后,隨機分為4個組,12只/組。分別為:(1)磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組(A組);(2)DC疫苗組(B組);(3)CpG-ODN組(C組);(4)DC+CpG-ODN聯合治療組(D組)。每組又隨機分2個亞組,每個亞組6只。亞組1:用于觀察腫瘤生長及荷瘤小鼠存活情況。卡尺測定腫瘤的長徑a和短徑b,按v=1/2ab2算出體積。2次/周,繪制腫瘤體積變化曲線,繼續觀察小鼠死亡情況,直至其中1組小鼠死亡達到50%時停止體積測量。亞組2:用于測量瘤重、體積:接種腫瘤細胞第21天頸椎脫臼法處死全部亞組6只小鼠,稱取瘤重,按上法計算腫瘤體積,根據公式計算瘤重和體積抑制率,移植瘤瘤重抑制率(%)=(空白對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/空白對照組平均瘤重×100%,移植瘤體積抑制率(%)=(空白對照組平均體積-治療組平均體積)/空白對照組平均體積×100%。腫瘤組織用于檢測浸潤性樹突狀細胞(tumor infiltrating dendritic cell,TIDC)表面CD80、CD86 表達。

1.6 治療時相點設置及治療方案 調整DC疫苗細胞濃度至1×106/mL,各組實驗動物分別于接種腫瘤細胞后第7、14天給予相應治療,PBS對照組注射PBS 0.2 mL,DC疫苗組注射DC疫苗0.1 mL+PBS 1 mL,CpG-ODN治療組注射濃度為500 μ g/mL的CpG-ODN溶液 0.2 mL,DC疫苗+CpG-ODN治療組注射DC疫苗0.1 mL+CpG-ODN溶液0.1 mL,治療方法采用腫瘤周圍多點注射。

1.7 腫瘤組織TIDC表面共刺激分子CD80、CD86的表達提取腫瘤組織浸潤淋巴細胞懸液,調整細胞濃度到5×105/mL,分別加入熒光FITC標記的大鼠抗小鼠CD80單克隆抗體、CD86單克隆抗體,FITC標記的同型IgG作為相應的陰性對照,行流式細胞儀檢測。

1.8 統計學方法 采用SPSS10.0軟件進行,各組數據以s表示,各組間比較采用非配對t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 荷瘤鼠腫瘤生長的一般情況 接種腫瘤細胞后第7天,小鼠腫瘤平均直徑可達0.5～1.0 cm,此時給予第1次治療。接種瘤細胞后第14天(即第1次治療7 d后)D組平均體積明顯小于A(P＜0.01)、B和C(P＜0.05)組,此時各組小鼠給予第2次相應治療。于接種腫瘤細胞第17天時,B、C組腫瘤體積也明顯小于A組(P＜0.01,P＜0.05),但B、C組之間腫瘤體積無明顯差異,D組平均體積小于A、B、C組(P＜0.01)(表1)。于接種瘤細胞后第 22、26、29天,PBS組各有1只小鼠死亡(腫瘤直徑均大于3 cm),終止體積測量觀察,此時其他 3個組小鼠也相繼出現死亡。

2.2 DC疫苗聯合CpG-ODN對膀胱腫瘤荷瘤鼠的抑瘤效應

各治療組亞組2荷瘤小鼠,于接種腫瘤第21天解剖,聯合治療組平均瘤重及平均體積均顯著小于其它各組(P＜0.01)。DC疫苗組及CpG-ODN組平均瘤重及平均體積均顯著小于PBS對照組(P＜0.01),見表 2。

表2 BTT739荷瘤小鼠不同治療組的抑瘤效應

2.3 DC疫苗聯合CpG-ODN對膀胱腫瘤荷瘤鼠的存活延長效應 DC疫苗聯合CpG-ODN治療組的荷瘤生存期長于DC組、CpG-ODN組及PBS對照組,DC組、CpG-ODN組荷瘤小鼠生存期長于PBS對照組(P＜0.05),見封2圖1。

2.4 腫瘤組織TIDC表面分子CD80及CD86的表達 DC+CpG-ODN組腫瘤組織中TIDC表面共刺激分子CD80、CD86表達水平高于DC組及PBS對照組(P＜0.01),雖略高于CpGODN組,但差異無統計學意義(P＞0.05)。CpG-ODN組腫瘤組織中TIDC表面CD80、CD86表達水平高于DC組及PBS對照組(P＜0.05),在DC組中二者表達雖略高于PBS對照組,但差異無統計學意義(P＞0.05),見表3。

表3 小鼠腫瘤組織中TIDC表面CD80、CD86的表達(%,

表3 小鼠腫瘤組織中TIDC表面CD80、CD86的表達(%,

a:與A、B組比較,P＜0.01;b:與A組比較,P＜0.01;c:與D組比較,P＜0.05。

組別 CD80 CD86 A 組 11.32±1.18 12.65±1.22 B組 13.02±2.64 14.63±3.08 C組 17.75±3.13a 18.72±2.79bc D組 19.82±3.36a 21.85±4.31a

3 討 論

腫瘤細胞可通過下調腫瘤相關抗原、低表達或不表達主要組織相容性復合物(MHC)分子和共刺激分子,使抗原不能被有效遞呈給T細胞以產生特異性的抗瘤效應,因此激發有效的T細胞介導的抗瘤免疫反應是提高腫瘤免疫治療效果的關鍵。單純的抗原不能活化T淋巴細胞,必須經過抗原遞呈細胞(APC)遞呈,因為T淋巴細胞活化需要抗原和輔助分子雙信號才能有效地誘導細胞毒T淋巴細胞(CT L)形成,發揮抗瘤效應。負載腫瘤抗原的DC疫苗由于可通過DC表面M HC類分子、共刺激分子將各種已知或未知的腫瘤相關抗原信息得到有效遞呈,因此作為理想的腫瘤疫苗在實驗和臨床研究受到廣泛重視。

CpG基序(CpG motifs)是一個含胞嘧啶(cytosine,C)和鳥嘌呤核苷酸(guanine,G)的二核苷酸。人工合成的CpG-ODN作為一種新型免疫佐劑,多項動物實驗研究表明單獨應用可有效治療腫瘤[6-7]。CpG-ODN通過誘導DC的成熟和遷移,從而增強對抗原反應性T細胞刺激能力而間接發揮作用。腫瘤局部注射CpG-ODN后可活化APC,促進其成熟并遷移至局部淋巴結激活腫瘤特異性T細胞,T淋巴細胞活化后從淋巴結到達腫瘤部位而發揮效應。目前CpG-ODN聯合抗體、細胞因子治療腫瘤的研究已逐漸開展,體外實驗已顯示出了良好效果,但CpG-ODN能否增強DC疫苗的抗腫瘤效應,其機制如何等問題研究的甚少,為此本研究觀察了CpG-ODN對DC疫苗治療小鼠膀胱腫瘤作用的影響。

本研究的實驗結果顯示,21 d時DC疫苗聯合CpG-ODN治療組的荷瘤鼠平均瘤重和平均體積均顯著低于DC疫苗組、CpG-ODN組、PBS對照組,而荷瘤生存期顯著長于其它各組,結果說明DC疫苗聯合CpG-ODN對膀胱腫瘤荷瘤鼠具有較強的抑瘤效應和延長生存期作用,而且這種作用強于單獨應用CpG-ODN、DC疫苗治療,顯示了CpG-ODN增強 DC疫苗抗腫瘤效應。DC疫苗聯合CpG-ODN治療組及CpG-ODN組腫瘤組織中TIDC表面共刺激分子CD80、CD86的表達明顯高于PBS對照組及DC疫苗組,CD80、CD86為成熟DC表面特異性標志,這些表面分子的參與是DC完成其抗原遞呈功能所必須,表明CpG-ODN腫瘤周圍注射后可增強腫瘤微環境中DC的成熟和活化,從而發揮免疫學效應,與 Heckelsmiller等[8]報道的結果相似。

本研究的實驗結果發現,CpG-ODN可增強負載腫瘤抗原的DC疫苗的免疫治療作用,提示其激發了機體強而有效的抗腫瘤免疫應答。結合前期實驗結果[2],本研究認為其作用機制可能與以下幾個方面有關:(1)CpG-ODN具有極強的誘導DC成熟、促進Th1型細胞因子分泌、誘導免疫應答向Th1型轉化的作用,成熟的DC具有強大的刺激T淋巴細胞增殖的能力;(2)DC高表達M HC-Ⅰ、Ⅱ類分子和CD80/CD86等共刺激分子,為T淋巴細胞充分活化提供信號刺激;(3)CpG-ODN可增強DC疫苗誘導的CT L免疫殺傷活性,提高細胞因子干擾素-γ(IFN-γ)分泌,從而誘導腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞增殖。CpG-ODN可維持長期的腫瘤特異性免疫反應,有研究表明CpG-ODN可以抑制DC的凋亡,延長DC的生存期[9],這對于逆轉腫瘤微環境導致的DC數量減少、功能受抑制具有重要意義,同時腫瘤局部CpG-ODN可引起T淋巴細胞向腫瘤部位浸潤,促進CD8+T細胞毒性反應的啟動。CpG-ODN無免疫原性,不會導致自身免疫反應,因此是一種理想的DC激活劑,可望應用于體內免疫調節。

[1] Pilon TS,Li W,Briggs JJ,et al.Immunostimulatory effects of CpG-ODN upon dendritic cell-based immunotherapy in a murine melanoma model[J].J Immunother,2006,29(4):381.

[2] 聶志林,靳風爍,梁培禾,等.CpG-ODN促進小鼠骨髓來源的樹突狀細胞成熟作用的實驗研究[J].重慶醫學,2008,37(2):136.

[3] Actins H,Davis BR,Kirby JA,et al.Polarisation of a T-helper cell immune response by activation of dendritic cells with CpG-containing oligonucleotides:a potentiao therapeutic regime:for bladder cancer immunotherapy[J].Br J Cancer,2003,89(12):2312.

[4] 高維實,閔軍,褚忠華,等.肝癌細胞凍融抗原負載樹突狀細胞瘤苗的制備與活化[J].中國病理生理雜志,2003,19(9):1279.

[5] Silke G,Michael S,Herbert R.Dendritic cells pulsed with tumor-derived lysate augment T cell mediated tumor cell lysis[J].Otolaryngol Head Neck Surg,2004,131(2):176.

[6] Baines J,Celis E.Immune-mediated tumor regression induced by CpG-containing oligodeoxynucleotides[J].Clin Cancer Res,2003,9(7):2693.

[7] Heckelsmiller K,Rall K,Beck S,et al.Peritumoral CpG DNA elicits a coordinated response of CD8 T cells and innate effectors to cure established tumorsin a murine colon carcinoma model[J].J Immunol,2002,169(7):3892.

[8] Heckelsmiller K,Beck S,Rall K,et al.Combined dendritic cell-and CpG oligonucleotide-based immune therapy cures large murine tumors that resist chemotherapy[J].Eur J Immunol,2002,32:3235.

[9] 杜宇琛,林蘋,張潔,等.CpG-ODN加強樹突狀細胞疫苗抗Lewis肺癌的研究[J].中華腫瘤雜志,2005,27(1):1.