寧夏漢族人126名甘露糖結合凝集素基因多態性分析*

馬力通 ,李 珺,王玉炯

(1.內蒙古科技大學生物工程與技術研究所,包頭 014010;2.寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室,銀川 750021)

甘露糖結合凝集素(mannose binding lectin,MBL)是參加天然免疫的宿主防御分子,它能夠通過凝集素途徑激活補體系統和吞噬作用從而在宿主免疫防御中發揮重要作用[1]。迄今為止,所發現的MBL基因結構區突變均為第1外顯子的點突變,分別是密碼子 54(GGC→GAC,Gly→Asp)、57(GGA→GAA,Gly→Glu)以及密碼子 52(CGT→TGT,Arg→Cys)(簡稱為MBL-54、MBL-57和MBL-52,相應突變的等位基因命名為B、C、D,野生型為 A),這些基因的突變干擾了M BL形成穩定的功能性的多聚體,使血清中MBL水平下降,從而導致了調理缺陷,這與臨床反復感染、系統性紅斑狼瘡、艾滋病以及乙型肝炎等多種疾病的發生相關。在MBL研究的基礎上,臨床治療中研究者成功嘗試輸入天然血漿MBL或輸入重組M BL來改善由MBL缺失引起的慢性疾病的狀況[2]。MBL基因點突變存在種族差異。目前,尚無寧夏漢族人群MBL基因突變類型及其頻率研究的報道。為此研究中國寧夏漢族人群的MBL基因突變,為進一步了解MBL基因突變與疾病的關系提供數據支持。

1 對象與方法

1.1 研究對象 126名無血緣關系的健康個體均來自于寧夏地區,其中男84名,女42名,年齡 6～69歲,其父母均為寧夏漢族。在知情同意的原則下,抽取研究個體的外周靜脈血待用。

1.2 MBL基因的擴增 參照文獻[3]提取外周血基因組DNA,以所提取基因組DNA作為模板擴增MBL基因外顯子1,參照文獻[4]設計引物,引物由華美生物公司合成。引物序列為(1)M BL54和 MBL57的 PCR引物序列,Forward:5′-AGT CGA CCC AGA TTG TAG GAC AGA G-3′,Reverse:5′-AGG ATC CAG GCA GTT TCC TCT GGA AGG-3′。(2)MBL52的 PCR引物序列,Forward:5′-CAT CAA CGG CTT CCC AGG CAA AGA CGC G-3′,Reverse:5′-AGG ATC CAG GCA GT T TCC TCT GGA AGG-3′。PCR反應體系為20μ L:基因組 DNA 1.5 μ L,10 ×PCR Buffer 2 μ L,2 μ M 引物各 2 μ L,2.5 mM dNTPs 1.6 μ L,5 u/mL Taq DNA 聚合 酶 0.2 μ L,10.7 μ L ddH2O。PCR反應條件為(1)MBL54和 MBL57的反應條件:94℃4 min;94℃30 s,58℃40 s,72℃60 s,35個循環;最后72℃5 min。(2)MBL52的反應條件:在密碼子52位處利用SDM-PCR引入一個新的酶切位點 MluⅠ,其PCR反應條件為94℃4 min;94℃40 s,65℃40 s,72℃60 s,28個循環;最后72℃5 min。PCR擴增產物20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離,在紫外燈下觀察結果。

1.3 限制性內切酶酶切 酶切反應體系15 μ L PCR擴增產物 1.5 μ L,Buffer 2 μ L,BSA 0.2 μ L,限 制性內切酶 0.2 μ L,ddH2O 11.1 μ L。PCR 擴增產物分別被 BanⅠ 、MboⅡ 、M luⅠ于50℃、37℃、37℃酶切4～5 h。酶切產物經80 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,電泳結束后常規銀染,凝膠成像儀觀察結果并拍照。

1.4 統計學方法 計算出寧夏漢族MBL基因的各種基因型頻率和等位基因頻率,使用SPSS12.0軟件包進行數據統計處理,利用χ2檢驗分析MBL基因多態性分布是否符合Hardy-Weinberg平衡以及各組間差異,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MBL基因多態性PCR-RFLP結果 見圖1。

圖1 MBL基因多態性PCR-RFLP結果

2.2 寧夏漢族MBL基因多態性分布情況 在寧夏漢族只檢測出兩種等位基因野生型A和變異型B(54位密碼子由GGC→GAC)未檢出變異型C、D等位基因。126名共檢出野生型AA為90名,突變雜合型AB為35名,突變純合型BB為1名;基因型頻率分別為0.714 3,0.277 8,0.007 9;A,B基因頻率分別為0.853 2,0.146 8。經χ2檢驗,符合 Hardy-Weinberg平衡定律,說明本研究人群具有群體代表性。

2.3 與其他漢族人群M BL基因多態性分布的比較 寧夏漢族與廣東漢族[5]均只檢出 A、B兩種等位基因,經χ2檢驗,寧夏漢族與廣東漢族[5]之間MBL基因多態性分布差異有統計學意義(P＜0.05,表1)。并且前者B的等位基因頻率明顯高于后者。

表1 寧夏、廣東兩地漢族MBL基因多態性分布情況

3 討 論

MBL是第1個被發現的具有防御功能的C型凝集素。編碼MBL的基因含有4個外顯子,分別編碼N-端富含半胱氨酸區、膠原樣區、頸區和糖識別區。其中外顯子1編碼N-端富含半胱氨酸區和部分膠原區。MBL結構基因外顯子1第52、54、57位的突變使其產物不能形成穩定的功能性的多聚體結構,從而造成MBL不能發揮調理作用和激活補體凝集素途徑的作用。

人群中MBL的基因突變率很高,并且MBL結構基因各點突變的基因頻率與種族有關。南部非洲人以57位密碼突變多見。MBL-54突變主要發生在歐洲、亞洲人群中,而在黑人中MBL-54突變極罕見。MBL-52突變少見且種族差別不明顯。國外近年來已在幾個種族人群中研究MBL基因多態性與感染性疾病、自身免疫性疾病的相關性[6]。國內對漢、維、蒙、藏、彝族的研究中未發現MBL-52、MBL-57的基因突變,但是MBL-54的基因突變卻很常見[7]。本文所取樣本為一般人群,除了要求為漢族外,未作任何限制,故可以代表寧夏地區的漢族人群。

本實驗確定了寧夏漢族人群MBL基因多態性位點等位基因的分布情況,研究結果顯示,寧夏漢族人群與文獻[5]中的廣東地區漢族相比較,M BL基因多態性分布差異顯著,并且寧夏漢族人群B的等位基因頻率明顯高于后者。漢族是中華民族的主要成員。漢族的形成和發展,經歷了一個十分復雜的融合、遷移的歷史過程,是歷史上融合了許多古代的非漢族人群而形成的。杜若甫和肖春杰[8-9]認為以長江為界,中國漢族人群分南、北兩大類型。各地漢族與當地的少數民族在遺傳結構上十分相近,而南、北方漢族的遺傳結構卻相差甚遠,接近于南、北方少數民族間的平均差異。寧夏漢族MBL基因多態性分布與廣東漢族[5]相比有明顯差異,證實了同一人種內部MBL各等位基因分布存在地理差異也進一步支持中國漢族人群可分為南北兩類的假設。同時本研究對寧夏漢族MBL基因多態性獲得的數據為進一步研究MBL基因突變與疾病間的關系提供數據支持。

[1] Eveline CA,Andy IH,Jelle S,et al.Mannose binding lectin plays a crucial role in innate immunity against yeast by enhanced complement activation and enhanced uptake of polymorphonuclear cells[J].BMC Microbiol,2008,18:229.

[2] Takahashi K,Shi L,Gowda LD,et al.Relative roles of complement factor 3 and mannose-binding lectin in host defense against infection[J].Infect Immun,2005,73(12):8188.

[3] 黃霞,毛偉,王蓉感,等.用PCR-SSP方法研究重慶地區人群HLA-DRB1基因多態性[J].重慶醫學,2005,34(2):242.

[4] Malik S,Arias M,Di Flumeri C,et al.Absence of association between mannose binding lectin gene polymorphisms and HIV-ⅠColombian population[J].Immunogenetics,2003,55(1):49.

[5] 王方勇,陳政良,呂成偉,等.廣東地區漢族人M BL基因GGC54GAC點突變的初步篩查[J].免疫學雜志,2002,18(B06):1.

[6] Peter G,Flemming L,Hans OM,et al.Mannose-binding lectin deficiency-revisited[J].Mol Immunol,2003,40(2-4):73.

[7] 施紅,王福生,金磊,等.中國五個民族的甘露糖結合蛋白基因多態性特點及意義[J].中華醫學遺傳學雜志,2001,18(3):202.

[8] 杜若甫,肖春杰.從遺傳學探討中華民族的源與流[J].中國社會科學,1997,4:139.

[9] 肖春杰,杜若甫,Cavalli-Sforza LL.中國人群基因頻率的主成分分析[J].中國科學(C輯),2000,30(4):434.