宮頸上皮內瘤變和宮頸癌組織中Survivin與Bcl-2的表達及相關性

朱華，施錚錚，張虎祥，萬麗，楊孝軍，鄭飛云

(溫州醫學院附屬第一醫院，浙江 溫州 325000，1.婦產科；2.病理科)

凋亡抑制和增殖能力增強是腫瘤發生的兩大主要機制。存活素（Survivin）是新近發現的一種凋亡抑制基因，它是凋亡抑制蛋白（inhibition apoptosis protein，IAP）家族中結構最簡單的蛋白分子，也是至今發現抗凋亡作用最強的基因。Survivin基因在正常組織中不表達，而在幾乎所有被研究的腫瘤組織中呈陽性表達[1]，這一特點為腫瘤的診斷和治療提供了新的靶點。本研究采用原位雜交法檢測Survivin在宮頸癌及宮頸上皮內瘤變（CIN）中的表達，采用免疫組化法檢測Bcl-2蛋白的表達，探討兩者在宮頸癌發生、發展中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 宮頸浸潤癌81例，CIN 74例，以同期20例正常宮頸組織作對照。均為取自本院2006年1月-2008年3月間經病理證實的臨床資料較完整的宮頸標本。患者年齡19～78歲，平均（40.1±11.2）歲。取材前未接受任何其他治療。所有標本及時以4%多聚甲醛(含有1/1000 DEPC)固定，石蠟包埋，4μm連續切片。

1.2 臨床分期、病理分型及病理分級 74例CIN中包括CINI級13例，CINII級26例，CINIII級35例。81例宮頸浸潤癌中包括70例鱗癌和11例腺癌，根據1970年再次修訂的FLGO臨床分期標準，分為Ia期9例，Ib期17例，IIa期33例，IIb期12例，III期10例；按組織病理學分級分為高分化14例，中分化29例，低分化38例；按照腫瘤生長類型分為外生型39例，內生型15例，潰瘍型16例，頸管型11例。81例宮頸癌患者中54例行廣泛性子宮切除術＋盆腔淋巴結清掃術（包括Ia期3例、Ib期17例、IIa期33例、IIb期1例），有淋巴結轉移者33例，無轉移21例。

1.3 主要試劑 鼠抗人Bcl-2多克隆抗體和免疫組化試劑盒（即用型二步法）購自北京中杉生物技術公司。Survivin原位雜交檢測試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司，針對人Survivin靶基因的mRNA引物序列為：①5’-CCTGG CAGCC CTTTC TCAAG GACCA CCGCA-3’；② 5’-AAGCA TTCGT CCGGT TGCGC TTTCC TTTCT-3’；③ 5’-AGAAA GTGCG CCGTG CCATC GAGCA GCTGG-3’。

1.4 測定方法

1.4.1 原位雜交法檢測Survivin mRNA表達：地高辛標記的Survivin mRNA寡核苷酸探針檢測石蠟包埋組織的Survivin mRNA序列：切片脫蠟，0.5% H2O2室溫處理30 min，加3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶，37 ℃消化，暴露Survivin mRNA核酸片段，滴加預雜交液，42 ℃恒溫4 h，滴加雜交液，42 ℃恒溫箱過夜，梯度SSC洗滌，依次滴加封閉液，生物素化鼠抗地高辛，SABC，DAB顯色，復染，透明，封片鏡檢。以不加Survivin探針只加預雜交液作為陰性對照。

1.4.2 免疫組織化學法檢測Bcl-2蛋白表達：按常規免疫組化試劑盒即用型二步法操作步驟進行。組織切片脫蠟，微波修復抗原，3% H2O2阻斷劑孵育10 min，PBS液沖洗。加入1:50 Bcl-2鼠抗人單克隆抗體，4 ℃冰箱過夜。PBS沖洗，加入即用型二抗PV-6000，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，透明，封片鏡檢。用PBS液代替一抗作為陰性對照，用已知陽性的乳腺癌作陽性對照。所有切片均在相同條件下進行。

1.5 結果評價標準 Survivin和Bcl-2陽性表現為細胞漿中出現淡黃色至棕黃色顆粒。隨機觀察10個高倍鏡視野，按每高倍鏡視野陽性細胞數百分比記分：陽性細胞數小于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，大于75%為4分。按著色強度記分：染色呈淡黃色者記為1分，染色呈黃色者記為2分，染色呈棕黃色者記為3分。兩種記分的乘積即為陽性強度：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.6 統計學處理方法 率的比較采用x2檢驗或Fisher精確概率法，相關性檢驗采用Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 Survivin mRNA，Bcl-2在正常子宮頸、CIN、宮頸癌中的表達（見表1及圖1～6） Survivin，Bcl-2陽性表達染色主要定位于細胞漿，呈淡黃色或棕黃色顆粒，局灶性或彌漫性分布。由表1可見，Survivin，Bcl-2在正常宮頸組織中不表達，在宮頸癌和CIN中表達的陽性率顯著高于正常宮頸組織（P<0.01），且在宮頸癌中表達的陽性率高于 CIN（P<0.01）。

表1 Survivin，Bcl-2在正常子宮頸、CIN和宮頸癌中的表達

圖2 Survivin mRNA在CIN中的弱陽性表達(ISH，×400)

圖3 Survivin mRNA在宮頸癌中的陽性表達(ISH，×200)

圖4 Bcl-2在正常宮頸組織中的陰性表達(SP，×200)

圖5 Bcl-2在CIN中的弱陽性表達(SP，×200)

圖6 Bcl-2在宮頸癌中的陽性表達(SP，×400)

2.2 Survivin，Bcl-2表達與宮頸癌臨床病理特征的關系 Survivin，Bcl-2陽性表達與腫瘤組織分化、臨床分期有關。Survivin的陽性表達還與淋巴結轉移有關,隨著腫瘤組織分化程度的降低和臨床分期的升高，Survivin mRNA表達陽性率逐漸上升。宮頸癌IIb～III期組與I～IIa期組間、低分化組與中～高分化組之間，兩者表達均有差異(分別為P<0.05或P<0.01)；Survivin在宮頸癌有盆腔淋巴結轉移組中的陽性表達高于無淋巴結轉移組(P<0.01)，而Bcl-2表達與宮頸癌的組織病理類型、腫塊生長類型和淋巴結轉移無相關性(P＞0.05)（見表2）。

表2175 例宮頸組織中Survivin和Bcl-2的表達與臨床病理特征的關系

3 討論

Survivin基因是于1997年由Altier利用效應細胞蛋白酶受體1cDNA在人基因組庫中首次篩選克隆出，定位于17q25。它是活性最強的凋亡抑制蛋白，主要通過間接或直接抑制半胱氨酸蛋白酶caspase-3和caspase-7的活性而發揮抗凋亡作用[2-3]。

Saiton等[4]采用RT-PCR技術研究了7種宮頸癌細胞株和25例宮頸癌組織中Survivin mRNA的表達，發現在所有的標本中均可檢測到Survivin mRNA。在之后的定量測定中發現，Survivin mRNA的表達在宮頸癌細胞株中高于正常宮頸組織，而在88%的宮頸癌組織中其表達水平是正常組織的2倍。王梅等[5]又用免疫組化SP法從蛋白水平對宮頸癌中Survivin進行檢測，發現59例宮頸癌組織中41例(占69.5%)有Survivin表達，而在10例正常宮頸組織中未發現Survivin表達。本研究亦發現Survivin mRNA在正常宮頸組織中未表達，在CIN和宮頸癌組織中逐漸升高，差異有顯著性。隨著組織分化惡性程度的增高，或腫瘤臨床期別的增高，Survivin的陽性表達率亦相應上升，且其表達與淋巴結的轉移亦有顯著相關性。由此表明Survivin基因的表達與宮頸癌的發生、發展有密切相關，它可能預示著腫瘤具有較高的侵襲性和不良預后[6]。Survivin可能通過抑制細胞凋亡、促進細胞增殖而發揮其作用，因此Survivin基因是一個有潛在價值的腫瘤標志物[7]。

Bcl-2基因是最早在B細胞白血病和濾泡性淋巴瘤的研究中被發現的細胞凋亡抑制基因，定位于染色體18q21，它可通過封閉細胞核轉運、抑制細胞內鈣離子濃度升高、抗氧化而發揮抗凋亡作用。它是迄今為止研究較深入的抗凋亡基因之一[8]。在本研究中，發現Bcl-2蛋白同樣在正常宮頸組織、CIN和宮頸癌中有逐漸增高的表達，且兩兩之間差異有顯著性，表明Bcl-2基因亦參與了正常宮頸組織-CIN-宮頸癌的病變過程。

同時，在本實驗中還發現Survivin的表達和Bcl-2有正相關性，目前兩者協同致病機制還不清楚。在CIN階段Survivin和Bcl-2即有表達，提示此兩基因在宮頸癌惡變的早期即有表達，且隨著疾病的發展而進一步增強。宮頸癌IIb期以上患者的臨床標本出現兩者的高表達率，低分化標本出現高表達率等均提示兩者表達與此類患者的不良預后有關，對臨床治療有指導意義。有報道稱Survivin可在Bcl-2的下游阻斷半胱氨酸蛋白酶caspase-3和caspase-7凋亡調節通路[9]。

據推測兩者可能通過相似的啟動序列，共同協調轉錄而導致宮頸癌的病變。也可能是由于Survivin基因所在的染色體不穩定，導致t（14，18）易位，而引發Bcl-2基因轉錄激活，而細胞凋亡途徑的紊亂則有利于腫瘤的生長和侵襲。兩基因的異常表達可能協調促進細胞逃離正常的監控機制，抑制腫瘤細胞凋亡，促進異常增殖，參與宮頸癌的發生、發展。但由于研究時間短，缺乏研究對象生存時間的隨訪資料，因此聯合檢測Survivin和Bcl-2表達是否為宮頸癌預后的客觀指標還有待深入研究。

實驗結果表明，Survivin和Bcl-2在CIN和宮頸癌組織中的異常表達與宮頸癌的發生、發展有密切關系，兩者呈正相關，其機制還有待進一步驗證。

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[4] Saitoh Y,Yaginuma Y,Ishikawa M. Analysis of Bcl-2,Bax and Survivin genes in uterine cancer[J]. Int J Oncol,1999,15(1):137-141.

[5] 王梅, 王冰, 王曉麗, 等. 凋亡相關基因Survivin在子宮頸癌組織中的表達及其與bcl-2、p53基因表達相關性的初步研究[J]. 中華婦產科雜志,2001,36(9):546-548.

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[7] 顧桂芳, 張美云. 宮頸癌組織中survivin基因表達的臨床意義[J].南京醫科大學學報:自然科學版,2008,28(2):232-235.

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[9] Deveraux QL,Takahashi R,Salvesen GS,et al. X-linked IAP is a direct inhibitor of cell-death proteases[J]. Nature,1997,388(6639):300-304.