白色念珠菌臨床株基因分型及耐藥性研究

卓佳，陳柏坤，黃慧燕，徐瑜，張洪勤

(溫州醫學院，浙江 溫州 325035，1.生物學實驗教學中心；2.附屬第二醫院)

白色念珠菌廣泛分布于自然界，也是人體的一種條件致病菌，正常人體的皮膚、口腔、腸道、肛門、陰道等處均可分離出該菌。近年來，隨著免疫抑制劑、介入性檢查治療手段的廣泛應用，腫瘤化療、放療，器官移植，艾滋病和社會老齡化等因素引起的免疫功能低下人群比例增高，臨床真菌感染呈上升趨勢，尤其是近年來抗真菌感染的治療或者預防性治療，導致真菌感染菌株及耐藥趨勢發生變化[1]。本研究采用PCR分型方法，對臨床分離的121株白色念珠菌進行基因分型，并對不同基因型白色念珠菌進行藥物敏感性研究。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 2006年7月至2008年3月間溫州醫學院附屬第二醫院臨床分離的121株白色念珠菌。標本來源于痰、咽拭子、生殖道分泌物、尿液、血液、糞便、腹水、傷口分泌物等。質控菌株為白色念珠菌ATCC60193，購自衛生部臨床檢驗中心。

1.2 儀器和試劑 法國科瑪嘉顯色培養基（CHRO Magar Candida）、API 20C AUX系統購自法國生物梅里埃公司；沙保弱瓊脂培養基、玉米-吐溫80培養基、含2%葡萄糖和0.5μg/mL美蘭的M-H瓊脂培養基、YEPD培養基(用于酵母原生質體融合)：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL，pH6.0（自制）；2%蝸牛酶；原生質緩沖液：1 mol/L山梨醇，0.02 mol/L檸檬酸，0.02 mol/L磷酸氫二鈉，pH5.8；SE緩沖液：1 mol/L山梨醇，0.0625 mol/L EDTA，pH 8.0；丹麥ROSCO Neo-Sensitab抗真菌藥敏紙片：制霉菌素（NYS）50μg/片，氟康唑（FL）25μg/片、酮康唑（KET）15μg/片，咪康唑（MTC）10μg/片，兩性霉素B（AMB）10μg/片，伊曲康唑（IT）8μg/片，由杭州康裕貿易有限公司提供；PCR使用試劑，包括Taq聚合酶以及引物的合成，由上海生工生物工程技術服務有限公司產品；梯度PCR儀（Eppendorf公司）；Bio-RAD凝膠成像及分析系統（gel-Doc2000美國）。

1.3 菌株的分離鑒定 標本按常規方法分離培養，對臨床懷疑真菌感染的標本接種沙保弱培養基，將分離到的酵母樣真菌接種于科瑪嘉顯色培養基，37 ℃孵育48 h，根據生長菌落的顏色作出鑒定，綠色菌落是白色念珠菌，紫色菌落是近平滑念珠菌，藍色菌落是熱帶念珠菌。

1.4 白色念珠菌DNA的提取 取沙保弱平板純培養的單個菌落接種于YEPD培養基中，35 ℃震蕩培養過夜。2000 r/min離心10 min，棄上清液。三蒸水洗2次。菌體加600μL 2%蝸牛酶溶于原生質緩沖液，30 ℃水浴2 h。3000 r/min離心10 min，棄上清液。SE緩沖液 400μL懸浮細胞。3000 r/min離心10 min，棄上清液。沉淀加入450μL TE緩沖液，10% SDS 50μL，65 ℃水浴30 min。加200μL 5 mol/L乙酸鉀，冰浴1 h。12000 r/min離心5 min，取上清液，加等體積無水異丙醇，混勻，-20 ℃靜置20 min。12000 r/min離心20 min，棄上清液。加70%無水乙醇500μL，混勻，12000 r/min離心5 min，棄上清液，自然干燥，溶解于50μL TE緩沖液，-20 ℃保存。

1.5 白色念珠菌基因分型 采用特異引物擴增白色念珠菌基因組DNA的25SrDNA基因的內含子區，以內含子大小及其中可轉座I型內含子片段的缺失或插入作為分型依據[2]。一對分型引物P1、P2分別位于可轉座內含子的兩翼。

P1：5’-ATA AGG GAA GTC GGC AAA ATA GAT CCG TAA-3’（up），30 mer，

P2：5’-CCT TGG CTG TGG TTT CGC TAG ATA GTA GAT-3’(down)，30 mer；

PCR反應總體積30μL，含TaqDNA聚合酶0.2μL（1 U），dNTP1.5μL，引物P1、P2各1μL。擴增程序：預變性94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30個循環；72 ℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

1.6 藥敏試驗 吸取一定量的0.5McFland菌懸液用生理鹽水1:1稀釋。以無菌棉拭子蘸取稀釋后的菌懸液從3個方向分別均勻接種于含2%葡萄糖和0.5μg/mL美蘭的M-H瓊脂培養基上，室溫靜置5～15 min，用無菌鑷子將藥敏紙片貼于瓊脂表面。室溫置15 min后轉入35 ℃恒溫培養箱培養18～24 h（未見生長者應培養24～48 h），判定標準按美國臨床實驗室標準委員會（NCCLS）酵母菌紙片擴散法敏感試驗2003年方案[3]，按要求測量抑菌環直徑，讀取藥敏結果。

1.7 統計學處理方法 率的比較采用x2檢驗。

2 結果

2.1 基因分型結果 以P1、P2為引物，以白色念珠菌DNA為模板進行PCR擴增，產物出現3種電泳圖譜，據此分為3型：A型為450 bp的單一條帶，B型為840 bp的單一條帶，C型出現450 bp和840 bp2條帶。質控菌株白色念珠菌ATCC60193的電泳圖譜與A型相同。121株白色念珠菌的分型結果為：A型83株，B型27株，C型11株。見圖1。

2.2 不同基因型白色念珠菌的耐藥性分析 3種基因型白色念珠菌對伊曲康唑、氟康唑、咪康唑的耐藥率差異有顯著性（P＜0.05）。B型白色念珠菌對氟康唑、咪康唑的的耐藥率明顯高于A型菌株(分別為x2=4.682，P=0.030；x2=3.912，P=0.048)。C型伊曲康唑的耐藥率明顯高于A型菌株（x2=4.220，P=0.040）。具體見表1。

表1 A、B、C型白色念珠菌耐藥性分析

3 討論

隨著白色念珠菌臨床病例不斷增加，分子分型技術已成為研究念珠菌病流行病學及合理選擇藥物的基礎。rDNA廣泛存在于各種生物體內，在進化過程中具有相同的起源和功能，可以反映物種間的進化關系，已被廣泛應用于多種生物的鑒定、分型及物種進化分析。據證實[2，4]，白色念珠菌在25SrDNA編碼區內存在一可轉座I型內含子，內含子中至少存在三個插入片段：252、341、379 bp。形成可轉座I型內含子的大小可有三種：379 bp（插入379 bp）、621 bp（插入379 bp和252 bp）、962 bp（插入379 bp、252 bp和341 bp）。5種型別中，A型（450 bp）無內含子，B型（840 bp）為379 bp內含子，D型（1080 bp）為621 bp內含子，E型（1400 bp）為962 bp內含子。379 bp內含子對基因中核糖體串聯區的不對稱插入形成C型（450和840 bp），也有學者認為C型可能是A型和B型通過有性繁殖方式產生的，或是兩組的過渡型，但是目前還沒有定論。

本實驗中121株臨床分離的白色念珠菌經PCR分為三型：A型67株，B型43株，C型11株。未發現D型（1080 bp）和E型（1400 bp）。A型為主要基因型，A型比例遠遠大于其他兩型，與國內亓慶國等[5]研究相一致；而Chen等[6]對臺灣分離的65株白色念珠菌分析表明A、B型比例相當，表明不同地區或不同研究對象白色念珠菌基因型的分布是不同的。

121株白色念珠菌的基因分型和真菌藥敏實驗結合分析，發現3種基因型白色念珠菌對伊曲康唑、氟康唑、咪康唑的耐藥率差異有顯著性（P＜0.05），對其他抗真菌藥物的耐藥率差異無顯著性。B型和C型白色念珠菌對唑類藥物的耐藥率明顯高于A型菌株。由此推論白色念珠菌特定基因型可能對某種抗真菌藥物易產生耐藥性，至于其耐藥機制是否與I型內含子有關，目前還沒有相關報道，有待于進一步研究。

臨床實驗室應積極開展真菌耐藥性監測，為臨床提供用藥依據，指導臨床合理使用抗真菌藥物，以達到有針對性的治療目標，預防和控制耐藥菌株的產生和增加。恰當的基因分型可為研究白色念珠菌臨床耐藥的分子機制及流行病學調查提供基礎，對控制真菌感染具有重大意義。

[1] Sandven P. Detection of fluconazole-resistant Candida strains by a disk diffusion screening test[J].J Clin Microbiol,1999,37(12):3856-3859.

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[3] 徐應春,王彭,謝秀麗,等. 美國臨床實驗室標準委員會酵母菌紙片擴散法敏感試驗2003年版方案介紹[J].中華檢驗醫學雜志,2003,26(9):579-580.

[4] Tamura M, Watanabe K, Mikami Y, et al. Molecular characterization of new clinical isolates of Candida albicans and C.dubliniensis in Japan: analysis reveals a new genotype of C.albicans with group I intron [J]. J Clin M icrobiol, 2001,39(12):4309.

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[6] Chen KW, Chen YC,LOHJ, et al. Multilocus sequence typing for analyses of clonality of Candida albicans strains in Taiwan [J]. J Clin Microbiol, 2006,44(6):2172-2178.