糖尿病大鼠來源骨髓間充質干細胞體外培養觀察及其生物學特性

金培峰，張浩，鄭亮承，蔣成榜，孫成超

(1.溫州醫學院附屬第一醫院 心胸外科，浙江 溫州 325000；2.中國醫學科學院阜外心血管病醫院 衛生部心血管疾病再生醫學重點實驗室，北京 100037)

干細胞治療心肌梗死已被證實是一種較有前景的治療方法。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）由于具有取材容易、體外增殖能力強、低免疫原性、可分化為不同類型的成熟細胞等優點[1-2]，成為最佳的移植細胞來源。但是和其他體細胞類似，BMSCs也易受各種因素如：年齡、氧化應激和高糖[3-4]等的影響而導致其生物學性狀改變。

糖尿病患者復雜的體內環境，包括長期的高血糖、高血脂、酮體的增多、活性氧等，勢必會對自身體內的BMSCs產生影響[5-6]。目前國內外在干細胞治療心梗的研究中，大多采用正常或者年輕的BMSCs作為移植細胞來源。為了確定糖尿病體內環境對BMSCs的影響以及其能否作為自體移植的細胞來源，我們將以糖尿病大鼠來源的BMSCs作為研究對象，在體外培養條件下進行一系列的生物學特性檢測，就此問題進行初步探討。

1 材料和方法

1.1 動物 220g Spraque Dawley(SD)大鼠由溫州醫學院實驗動物中心提供，所有研究都經溫州醫學院實驗動物委員會批準。

1.2 主要試劑 DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco公司；鏈脲佐菌素（STZ）、Hoechst 33342購自Sigma公司；細胞低氧培養盒、缺氧催化劑購自BioM6rieux-sa(France)；膜聯蛋白(annexin)-V FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物公司；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自R&D公司。

1.3 糖尿病大鼠模型的制備 12只健康的SD大鼠隨機平均分為兩組，分別為糖尿病組和正常對照組。兩組大鼠在禁食12h后分別予單次腹腔注射STZ檸檬酸緩沖液(55mg/kg)和檸檬酸緩沖液。3 d后剪尾靜脈測血糖，以>16.67 mmol/L視為糖尿病模型成功，腹腔注射后3周復測1次尾靜脈血糖和體重，以確保血糖濃度>16.67 mmol/L。糖尿病模型合格的和正常對照組大鼠繼續飼養10周，為下面實驗做準備。

1.4 骨髓間充質干細胞的分離和培養 無菌條件下分別剝離糖尿病大鼠和正常對照大鼠的股骨和脛骨[3]，以全骨髓貼壁法分離并培養BMSCs，待狀態良好的第二代細胞生長達到70%～80%匯合時可用于以下實驗。

1.5 細胞增殖能力檢測 取生長良好的第二代骨髓間充質干細胞，于96孔板的每個孔中加入100μL細胞懸液，細胞數為1.5×103，培養基每2天更換一次。于細胞接種后的7 d內，每天取5個孔進行檢測，每個孔內加入CCK-8試劑10μL，置培養箱內孵育4 h后，用全自動酶標儀檢測490 nm（參比波長630 nm）的吸光度值（OD值），取平均值，以培養時間為橫坐標，以相應的OD值為縱坐標，描繪生長曲線。

1.6 間充質干細胞凋亡的檢測

1.6.1 細胞模擬缺血處理(無血清和低氧聯合處理)：當第二代細胞生長達到70%～80%匯合時用PBS沖洗2次，加入不含胎牛血清的DMEM培養基，然后迅速將細胞放入密閉低氧罐中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養6 h。

1.6.2 形態學檢測：將進行低氧和無血清處理后的細胞用PBS洗1次，然后加入含Hoechst33342的無血清DMEM培養基，Hoechst33342終濃度為0.1 mg/mL，室溫避光反應10 min。用熒光顯微鏡觀察，紫外光激發，觀察凋亡細胞并攝片。

1.6.3 流式檢測：取經低氧無血清處理的7×105個細胞，用0.125%胰蛋白酶/0.04% EDTA消化細胞后，4 ℃，以800 r/min離心4 min后，棄掉上清液；細胞用PBS沖洗1次后懸浮于200μL結合緩沖液。然后加入10μL 20μg/mL的異硫氰酸熒光素(FITC)標記的膜聯蛋白V(膜聯蛋白-V-FITC)，輕輕混勻后，4 ℃避光反應15 min。加入5μL 50μg/mL的PI，300μL結合緩沖液，輕輕混勻，用流式細胞儀檢測活細胞、早期和中晚期凋亡細胞及壞死細胞所占的比例。

1.7 血管內皮生長因子（VEGF）和胰島素生長因子-1（IGF-1）的ELISA檢測 將生長良好的第二代骨髓間充質干細胞用PBS沖洗1次后，添加不含血清DMEM培養基置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養6 h后，取上清液備用。按照ELISA試劑盒操作說明書，用雙抗體夾心法分別檢測細胞培養上清中VEGF和IGF-1的含量，每份標本設3個復孔。用全自動酶標儀測450 nm處吸光度值，取其平均值，根據所繪制的標準曲線計算出各個細胞因子的含量。

1.8 統計學處理方法 采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 大鼠BMSCs的培養和增殖能力檢測 采用常規細胞原代培養法，成功培養了糖尿病大鼠的BMSCs。相差顯微鏡下對細胞形態進行了觀察，如圖1A所示培養的原代細胞呈長梭型，集落生長，中間較密，夾雜著圓形高亮未貼壁的雜細胞，但是糖尿病大鼠的BMSCs所形成的集落較正常大鼠的明顯要小，而且貼壁后4～5 d才表現出成纖維樣生長特性。細胞傳代后，在第1代和第2代細胞生長呈現明顯的漩渦狀，但是相對于正常大鼠BMSCs飽滿的細胞形態，糖尿病大鼠的則表現為細胞伸展無力，且較為扁平。本實驗所用細胞均為第2代BMSCs。利用CCK-8檢測的結果顯示(見圖1B)，糖尿病來源的骨髓間充質干細胞增殖能力明顯較正常來源的低（P<0.01)。

圖1 A 在原代中，糖尿病組所形成的細胞集落明顯較正常組小，經傳代后細胞較正常的扁平并且伸展無力圖1B 在第1天和第2天，兩組細胞生長并無差異，隨時間增長，糖尿病組生長明顯較正常的減慢（*P<0.05，**P<0.01)

2.2 VEGF和IGF-1的分泌量 ELISA結果（見圖2）顯示糖尿病大鼠來源BMSCs的VEGF和IGF-1的分泌量較正常來源的明顯降低(分別為P<0.05，P<0.01)。

圖2 A，2B 糖尿病來源的骨髓間充質干細胞分泌的VEGF和IGF-1的量較正常組顯著降低（*P<0.05，**P<0.01）

2.3 細胞凋亡 在缺血無血清聯合處理后(圖3A)，相差顯微鏡照片可以顯示明顯的細胞凋亡表征，即胞核皺縮變圓，貼壁細胞數量明顯地減少。Hoechst33342染色后，正常細胞核呈彌散均勻的熒光， 而凋亡的細胞， 細胞核與細胞質中可見濃染致密的顆粒熒光， 被認為是典型的凋亡細胞。

圖3 A 凋亡預處理后，經Hoechst33342染色后細胞核為濃染致密的顆粒熒光；圖3B示經流式細胞學檢測后，糖尿病組凋亡系數較正常組明顯增高 (**P<0.01)

2.4 膜聯蛋白V/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡膜聯蛋白 糖尿病來源的BMSCs中早期凋亡細胞(膜聯蛋白為V+/PI-）較正常大鼠來源的明顯增多（P<0.01，見圖3B)；中晚期凋亡細胞（V+/PI+）和死亡細胞（V-/PI+）兩者差異無顯著性（P>0.05）。

3 討論

隨著冠心病發病機制研究的深入，更多的證據表明，作為代謝綜合征之一的糖尿病和冠心病的發生有著密切的關系[5]。而糖尿病患者體內的高糖、酮體、氧化產物等有害物質的增多，勢必對自體來源的BMSCs的性狀產生影響。在本研究中我們通過利用STZ誘導糖尿病大鼠模型，在經體外培養后發現，糖尿病來源的BMSCs在增殖能力上明顯減弱，并且在細胞的分泌和抗凋亡能力上也較正常大鼠來源的顯著降低。

在BMSCs治療心肌梗死的研究中，首先要在體外擴增得到移植所需的細胞量。我們在研究中發現，在原代培養中糖尿病來源細胞在貼壁后4～5 d才表現出成纖維樣生長的特性，且糖尿病來源的BMSCs的增殖能力明顯降低，并且細胞較為扁平。原代體外貼壁時間的延長和細胞形態的變化說明其對環境的適應能力降低，需要較長的時間來恢復其生長增殖能力。另外有研究表明，傳代后細胞變為扁平，具有這樣的形態特征為細胞衰老的表象[7]，并且與我們所得出的增殖能力的下降是相一致的。

另外在BMSCs移植提高梗死后的心功能上，干細胞所分泌的細胞因子被認為是提高心功能的主要因素之一[8]，其中VEGF和IGF-1在促進新生血管的生成和細胞增殖方面起著非常重要的作用。我們的研究表明，糖尿病來源的BMSCs其VEGF和IGF-1分泌量較正常來源的明顯降低。Liu等[9]利用高糖培養多功能前體細胞后，VEGF的分泌量也可以得到類似的結果，但是其細胞來源為正常的幼年大鼠。在本實驗中所采用的干細胞培養條件為正常的培養條件，說明糖尿病的體內環境對糖尿病來源的干細胞其分泌能力有不可逆的損害作用。另據研究表明，VEGF和IGF-1在糖尿病患者的腎臟和視網膜以及血液中的濃度明顯高于正常水平[10]，但是糖尿病自身來源的BMSCs所分泌的VEGF和IGF-1較正常的明顯降低，造成這種矛盾的結果，可能是不同的組織來源的細胞對于糖尿病內環境的反應性不同，并且VEGF和IGF-1在糖尿病腎病和視網膜病變等糖尿病并發癥的發展中起著重要的作用。至于細胞移植后分泌的細胞因子，是否會加速糖尿病并發癥的發展進程，需要更深入地研究。

影響干細胞治療心梗療效的另一重要因素是在干細胞移植后細胞在心梗區的存活率較低，而心肌梗死區缺血低氧的環境是導致細胞凋亡的主要原因。我們采用體外低氧無血清的方法建立細胞凋亡模型[11]，發現糖尿病組的抗凋亡能力明顯較正常組下降。現有的體外研究表明，體外的高糖、丙酮醛類、活性氧產物（ROS）等環境對細胞的凋亡起著很大的促進作用，而這些因素在糖尿病患者中均存在。另外，VEGF的分泌減少和糖尿病BMSCs在體外培養條件下的所表現出細胞衰老的形態學特征，抗細胞凋亡能力的下降也起著重要的促進作用。

目前關于糖尿病大鼠來源的BMSCs在增殖、分泌和抗凋亡能力下降方面的確切機制目前尚不清楚，可能與糖尿病體內復雜的病理生理條件造成干細胞的線粒體功能障礙[12]、高糖所導致的細胞復制性衰老[3]和相應的信號通道阻斷等有關[9]。在本實驗中，我們選擇均為同齡的大鼠作為實驗對象，避免了因年齡不同而造成的誤差；在細胞培養方面，均在體外正常的培養條件下進行，從而可以得出糖尿病對BMSCs的各種生物學性狀的損害是客觀存在的。

本研究也存在若干不足，如沒有將培養得到的糖尿病BMSCs移植回動物心梗模型體內，檢測其對心功能的改善情況。另外，在糖尿病來源的BMSCs在抗凋亡能力、增殖能力和分泌能力損傷的機制上，沒有做進一步的探討，這也是我們下一步實驗的方向。

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