Smad 2/3和Smad 4在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其相關(guān)性

劉貴鵬，王東嬌，李瑩瑩，張瑩，張璐，劉寧

（1.中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；2.中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院臨床流行病學(xué)教研室，沈陽 110001；3.遼陽市第三人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 遼陽 111000）

子宮內(nèi)膜癌為女性生殖器三大惡性腫瘤之一，目前對子宮內(nèi)膜癌的病因、發(fā)病機制仍不十分清楚，轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一種重要的細(xì)胞因子，具有抑制細(xì)胞分裂和增殖的作用，大量證據(jù)表明腫瘤的發(fā)生和惡性細(xì)胞對TGF-β產(chǎn)生抵抗作用關(guān)系密切［1］。Smad蛋白家族是生長因子信號傳遞途徑中從胞漿進(jìn)入胞核的中轉(zhuǎn)分子［2］。TGF-β/Smad通路與多種人類癌癥、惡性腫瘤及其生物學(xué)行為有關(guān)。Smad2/3、Smad4均為Smad家族的主要成員，且二者作為腫瘤抑制基因，在TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。許多研究表明，Smad2/3和Smad4在甲狀腺癌、乳腺癌、胃癌等許多癌癥中異常表達(dá)，在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。本研究檢測了體外正常子宮內(nèi)膜組織、非典型增生子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中Smad2/3和Smad4蛋白的表達(dá)，比較3種組織中二者表達(dá)的差異，從而闡明二者在子宮內(nèi)膜癌中的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2007-2009年中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院經(jīng)手術(shù)證實的子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本42例，子宮內(nèi)膜非典型增生標(biāo)本20例。42例子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本中腺癌標(biāo)本33例，其他類型癌標(biāo)本9例；按照FIGO標(biāo)準(zhǔn)行手術(shù)-病理分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期12例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例；按WHO標(biāo)準(zhǔn)分級：G1期15例、G2期12例、G3期15例。20例子宮內(nèi)膜非典型增生標(biāo)本中輕度7例，中度6例，重度7例。選取同期因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級、宮頸癌、附件腫瘤且未累及子宮而行手術(shù)切除的正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本20例，其中分泌期和增生期各10例，作為對照組。全部標(biāo)本均經(jīng)病理科專家確診。所有研究對象術(shù)前未行放、化療或激素治療，各組之間年齡無顯著性差異（Kruskal-Wallis H 檢驗，P=0.100）。

1.2 實驗方法

石蠟標(biāo)本4 μm連續(xù)切片，采用免疫組化S-P法。Smad2/3和Smad4的濃度為1∶100，按S-P試劑盒（產(chǎn)品編號SP-0023）實驗步驟操作，DAB染色試劑盒（產(chǎn)品編號C-0010）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。采用PBS代替一抗作空白對照，已知胃癌切片作為陽性對照。實驗所需一抗為兔抗人Smad2/3和Smad4多克隆抗體，二抗免疫組化試劑盒、S-P試劑盒、DAB染色試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 結(jié)果判斷

根據(jù)細(xì)胞著色強度（A）：無色為0分，淺黃為1分，棕黃為2分，棕褐為3分。根據(jù)顯色細(xì)胞的比例（B）：無顯色細(xì)胞為0分，<10%為1分，10%～50%為2分，50%～75%為3分，≥75%為4分。A×B≤2分為（-），3分為陽性（+），4分為強陽性（++），5分及以上為強陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

組間比較應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件中的χ2檢驗或SAS 8.2統(tǒng)計軟件中的Fisher確切概率法，相關(guān)性用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件中的Spearman等級相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Smad2/3和Smad4蛋白的表達(dá)情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，Smad2/3蛋白為棕黃色或橘黃色顆粒，存在于細(xì)胞胞質(zhì)中（少數(shù)位于胞核中），Smad4蛋白為棕黃色或橘黃色顆粒，存在于細(xì)胞胞質(zhì)或胞核中。Smad2/3在正常子宮內(nèi)膜組織、非典型增生子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)陽性率分別為 85.0%、55.0%和 28.6%（χ2=17.676，P＜0.01）；Smad4在正常子宮內(nèi)膜組織、非典型增生子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)陽性率分別為90.0%、70.0%和 31.0%（χ2=21.520，P＜ 0.01）。見圖1，圖 2。

2.2 Smad2/3、Smad4蛋白的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌手術(shù)-病理分期及組織學(xué)分級的關(guān)系

Smad2/3、Smad4的表達(dá)均與手術(shù)-病理分期無關(guān) （χ2=1.540 0，P>0.05；χ2=0.757 6，P>0.05）；Smad2/3的表達(dá)與組織學(xué)分級有關(guān)，隨組織學(xué)分級的增加而表達(dá)減少（χ2=8.108 3，P＜ 0.05）。見表 1。

2.3 Smad2/3與Smad4蛋白表達(dá)的相關(guān)性

42例子宮內(nèi)膜癌組織中Smad2/3與Smad4同時表達(dá)陽性者14例，同時表達(dá)陰性者21例，Smad2/3陰性而Smad4陽性表達(dá)者3例，表達(dá)一致率為83.3%，Spearman等級相關(guān)分析顯示Smad2/3與Smad4表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.671，P＜0.01）。見表2。

3 討論

TGF-β是一種重要的細(xì)胞因子，廣泛參與細(xì)胞的分化、增殖、形態(tài)改變、黏附、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生及凋亡等［3，4］。Smad蛋白家族是生長因子信號傳遞途徑中從胞漿進(jìn)入胞核的中轉(zhuǎn)分子［2］，其失活或突變可以導(dǎo)致TGF-β生長抑制作用消失，已有研究證實，某些Smad基因的突變、失活、異常表達(dá)以及因泛素化等原因引起的Smad蛋白的功能喪失與許多人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［5～7］。

表1 Smad2/3、Smad4蛋白的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌手術(shù)-病理分期的關(guān)系Tab.1 Correlation of the expressions of Smad2/3 and Smad4 with surgical-pathologial staging and histological grade in endometrialcancer

表2 子宮內(nèi)膜癌中Smad2/3與Smad4表達(dá)的關(guān)系Tab.2 Relationship between the expressions of Smad2/3 and Smad4 in endometrialcancer

Smad家族成員分為3類［8］。第一類是R-Smad，即受體Smad，包括Smad1、Smad2/3、Smad5 和Smad8。Smad2/3由TGF-β激活素激活，特點是C端具有特征性絲氨酸序列，可被活化的TGF-βⅠ型受體磷酸化。第二類是Co-Smad，即Smad4，又稱共同伙伴基因，是腫瘤抑制基因DPC4的產(chǎn)物，是不同TGF-β超家族成員信號傳遞必需的中心轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，亦是TGF-β信號系統(tǒng)中抗增殖反應(yīng)和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的重要分子，在腫瘤的滅活中起著關(guān)鍵的作用［9］。第三類是 I-Smad，即抑制 Smad，包括 Smad6和Smad7，對TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起抑制作用。

在Samd家族中只有Smad2/3和Smad4的基因突變在人類腫瘤中被證實，而且已被確定為腫瘤抑制基因。本研究中，Smad2/3、Smad4在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)均較非典型增生及正常子宮內(nèi)膜組織中明顯減少。Smad2/3（R-Smad）的表達(dá)缺失，導(dǎo)致在TGF-β信號傳導(dǎo)途徑中活化的Ⅰ型受體失去激活的靶蛋白，信號傳遞中斷，細(xì)胞可逃脫TGF-β的抑制作用。在低分化子宮內(nèi)膜癌中，Smad2/3蛋白的表達(dá)較中分化、高分化癌明顯減少，推測Smad2/3的表達(dá)缺失與癌組織的分化有一定的關(guān)系。Smad4蛋白控制著TGF-β信號通路，在子宮內(nèi)膜組織中Smad4（Co-Smad）的突變及表達(dá)缺失使其不能與R-Smad形成復(fù)合物，不能進(jìn)入細(xì)胞核，TGF-β信號傳導(dǎo)中斷，TGF-β對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長增殖抑制作用喪失，從而促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展。但Smad4蛋白在子宮內(nèi)膜癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期中及在低分化、中分化、高分化子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)均未見明顯差異，尚不能說明Smad4在已發(fā)生癌變的組織中繼續(xù)參與子宮內(nèi)膜癌的侵襲及演進(jìn)。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Smad2/3與Smad4在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，這與已知的二者的生物學(xué)特性相一致。首先從二者在染色體18q21.1上的位置關(guān)系而言，Smad2/3和Smad4緊密相連［10］。另外，Smad2/3 屬于 R-Smad，Smad4 為 Co-Smad4，在TGF-β信號傳導(dǎo)時，R-Smad蛋白被活化的Ⅰ型受體激活后，與Co-Smad蛋白形成復(fù)合體，一并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，復(fù)合體在細(xì)胞核中指導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄，通過與核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子及靶基因啟動子的結(jié)合，達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的作用。二者缺失，導(dǎo)致信號傳遞中斷，使細(xì)胞逃脫TGF-β的抑制作用。

本研究結(jié)果進(jìn)一步證明了Smad2/3和Smad4的基因突變與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，且二者作為癌基因可能協(xié)同發(fā)揮作用。聯(lián)合檢測Smad2/3和Smad4蛋白在子宮內(nèi)膜癌變時的異常表達(dá)及二者之間的內(nèi)在關(guān)系，有助于從基因調(diào)控及蛋白表達(dá)水平認(rèn)識子宮內(nèi)膜癌及增殖性病變的病理機制、進(jìn)一步尋找靶向治療方法。

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