緩激肽對腦膠質(zhì)瘤大鼠occludin和ZO-1mRNA的調(diào)節(jié)和機制

劉麗波，薛一雪，王萍

（中國醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院神經(jīng)生物學教研室，沈陽 110001）

腦膠質(zhì)瘤是嚴重影響人類健康的疾病，其預后差、生存期短，除手術(shù)治療外，化療是腦膠質(zhì)瘤治療的主要手段之一，但由于血腫瘤屏障（blood-tumor barrier，BTB）的存在限制了抗腫瘤藥物進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，嚴重影響了化療療效［1］。為了將藥物轉(zhuǎn)運到腫瘤組織，選擇性地增加血腫瘤屏障的通透性是一個理想的策略，研究發(fā)現(xiàn)小劑量緩激肽（bradykinin，BK）可以選擇性開放血腫瘤屏障，卻不影響正常腦組織毛細血管的通透性［2］。藥物通過血腫瘤屏障到達腫瘤細胞主要有兩條途徑：增加吞飲小泡數(shù)量的跨細胞途徑和開放緊密連接的細胞旁途徑，研究證明緩激肽可同時通過上述兩條途徑選擇性開放血腫瘤屏障［3，4］。我們的前期研究進一步證明BK可通過降低腫瘤微血管的緊密連接相關(guān)蛋白occludin、zonula occluden-1（ZO-1）和 claudin-5 的蛋白水平開放緊密連接［5］，但BK是否能夠影響緊密連接相關(guān)蛋白的mRNA水平及其調(diào)節(jié)機制仍不清楚。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白 （cAMP response element binding protein，CREB）是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可能通過影響緊密連接相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性［6］。本研究旨在探討B(tài)K對緊密連接相關(guān)蛋白occludin和ZO-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，并分析可能的調(diào)節(jié)機制，進一步完善BK開放血腫瘤屏障緊密連接機制的闡述。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：健康雌性Wistar大鼠112只，體質(zhì)量180～200 g，購于中國醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 試劑和器材：緩激肽、葡聚糖購于Sigma Chemical公司；TRIzol購于Invit rogen公司；RT-PCR試劑盒購于大連TaKaRa公司；兔抗大鼠CREB和兔抗大鼠p-CREB抗體購于Cell Signaling公司；小鼠抗大鼠β-actin抗體購于Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗購于北京中杉公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱（Forma Scientific，美國）；超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司SW-CJ-1FD型）；立體定向儀（日本光電株式會社）；微量輸液泵（B.Braun Melsungen AG，德國）；臺式低溫超速離心機（3K18，德國）；分光光度計（Bausch＆Lomb，美國）；PCR 擴增儀 （Biometra，GER）；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀（Bio-Rad，美國）；轉(zhuǎn)印儀（DYY-Ⅲ 40B，北京市六一儀器廠）；-80℃超低溫冰箱（SANYO，日本）；恒溫冷凍切片機（Leica，德國）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型制備：實驗動物隨機分為假手術(shù)組，模型組，BK 5 min組，BK 10 min組，BK 15 min組，BK 30 min組，BK 60 min組。每組16只大鼠。假手術(shù)組為未進行腫瘤細胞移植的正常大鼠，模型組僅給予生理鹽水。

常規(guī)培養(yǎng)C6大鼠膠質(zhì)瘤細胞，用含有1.2%甲基纖維素的DMEM培養(yǎng)基制備C6膠質(zhì)瘤細胞懸液，濃度為1×105/μl備用。大鼠用10%水合氯醛（3.5 ml·kg-1）麻醉后，將其固定在腦立體定位儀上；將制備好的細胞懸液用微量注射器注入右側(cè)大腦基底核（前囟前1 mm，矢狀縫旁開3 mm，深4.5 mm）。腫瘤移植2周后用備用。

1.2.2 緩激肽灌注：C6膠質(zhì)瘤細胞移植2周后，用水合氯醛麻醉膠質(zhì)瘤大鼠，使其仰臥于操作臺上，進行腹側(cè)頸部正中切口，分離右側(cè)的頸總和頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈遠端，以10 μg·kg-1·min-1的速度從頸總動脈的近端灌注BK。在操作的同時監(jiān)測大鼠的體溫和血壓。

1.2.3 RT-PCR法檢測occludin和ZO-1mRNA表達：采用15%葡聚糖梯度離心的方法提取正常腦組織和腫瘤組織的微血管段，應(yīng)用TRIzol提取微血管段的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行PCR擴增。occludin引物：Sense 5′-GACCACTATGAAACCGAC TA-3′；Antisense 5′-CTCACTTCTCCAGCAACC-3′，擴增長度為 411 bp；ZO-1引物：Sense 5′-TGCTATTAC ACGGTCCTC-3′；Antisense 5′-TGGTGCTCCTAAACAATC-3′，擴增長度為 316 bp；β-actin引物：Sense 5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′；Antisense 5′-GCTCGGCCGTGGTGGTGAAGC-3′，擴增長度為 493 bp。以上引物由北京三博遠志公司合成。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃2 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃45 s，共30個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后用Bio-Rad凝膠成像儀成像，用Fluor Chen V 2.0 Stand Alone軟件對圖像進行分析，結(jié)果以 occludin/β-actin、ZO-1/β-actin 的整合光密度值 （integrated density value，IDV）的比值表示。

1.2.4 Western blot檢測CREB和p-CREB的蛋白表達：提取正常腦組織和腫瘤組織微血管段，將各組微血管段置于裂解緩沖液中勻漿，離心，取上清液，用考馬斯亮藍G-250結(jié)合法進行蛋白定量；等量蛋白（10～20 μg）經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在5%脫脂奶粉中4℃封閉過夜；分別用兔抗大鼠CREB多克隆抗體（1∶500稀釋）、兔抗大鼠p-CREB多克隆抗體（1∶800稀釋）和小鼠抗大鼠β-actin多克隆抗體（1∶1 000稀釋）與硝酸纖維素膜室溫孵育2 h；經(jīng)相應(yīng)二抗（1∶4 000稀釋）室溫孵育2 h后用增強的化學發(fā)光法檢測免疫復合物的表達。采用Chemi Imager 5500 V2.03軟件對蛋白條帶進行掃描，用Fluor Chen 2.0計算機圖像分析系統(tǒng)計算各條帶IDV，結(jié)果以CREB/β-actin和p-CREB/β-actin的IDV比值表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)用±s表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。組間比較用單因素方差分析，P<0.05認為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR法檢測occludin和ZO-1mRNA的表達

在假手術(shù)組和模型組occludin和ZO-1mRNA有較高的表達，BK作用5 min后，腫瘤微血管中oc－cludin和ZO-1mRNA表達開始減少，最低值出現(xiàn)在BK作用15 min時，而后逐漸增加，在60 min時基本恢復到模型組水平（圖1）。與假手術(shù)組和模型組相比，BK 15 min組occludinmRNA的表達分別減少了24.56%和42.22%，ZO-1mRNA的表達分別減少了32.58%和44.49%（表1）。

表1 緩激肽對occludin與ZO-1mRNA表達和CREB與p-CREB蛋白表達的影響（±s）Tab.1 Effect of bradykinin on the mRNAexpression of occludin and ZO-1 and the protein expression of CREB and p-CREB（±s）

表1 緩激肽對occludin與ZO-1mRNA表達和CREB與p-CREB蛋白表達的影響（±s）Tab.1 Effect of bradykinin on the mRNAexpression of occludin and ZO-1 and the protein expression of CREB and p-CREB（±s）

1）P<0.05 vs sham operated group；2）P<0.05 vs model group；3）P<0.01 vs model group.

IDV by RT-PCR IDV by Western blot Occludin ZO-1 CREB p-CREB Sham operated 8 0.916±0.049 1.438±0.061 1.176±0.039 0.478±0.022 Model 8 1.136±0.0531） 1.746±0.0621） 1.197±0.039 0.485±0.027 5-min BK 8 0.911±0.0512） 1.469±0.0732） 0.913±0.0352） 0.721±0.0292）10-min BK 8 0.782±0.0433） 1.227±0.0693） 0.623±0.0313） 0.921±0.0313）15-min BK 8 0.691±0.0481），3） 0.969±0.0741），3） 0.534±0.0363） 1.093±0.0323）30-min BK 8 0.953±0.0522） 1.377±0.0742） 1.032±0.034 0.694±0.024 60-min BK 8 1.102±0.062 1.651±0.067 1.136±0.033 0.585±0.023 Group n

2.2 Western blot檢測CREB和p-CREB的表達

在假手術(shù)組和模型組CREB有較高的表達，兩組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；BK作用5 min后，腫瘤微血管中CREB的蛋白表達水平開始降低，在BK作用15 min時降低最明顯（P<0.01），而后逐漸增加，在60 min時基本恢復到模型組的水平。與CREB的表達趨勢相反，在假手術(shù)組和模型組p-CREB僅有少量表達，兩組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；BK作用5 min后，腫瘤微血管中p-CREB的蛋白表達水平開始升高，在BK作用15 min時達到峰值（P<0.01），而后逐漸減弱，在60 min時基本恢復到模型組的水平（圖2，表1）。

3 討論

血腦屏障由基膜、周細胞、星型膠質(zhì)細胞終足和腦內(nèi)皮細胞組成，其中存在于相鄰內(nèi)皮細胞間的緊密連接在維持血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用，它可以限制親水性物質(zhì)和大分子物質(zhì)在細胞旁的擴散［7］。緊密連接主要由跨膜蛋白、胞質(zhì)附著蛋白和細胞骨架蛋白組成，已經(jīng)確定的幾個組成緊密連接的跨膜蛋白包括occludin、claudins和黏附連接分子；胞質(zhì)附著蛋白 ZO-1、ZO-2、ZO-3 和 cingulin［8］。ZO-1是第一個被確定的緊密連接相關(guān)蛋白，它是連接跨膜蛋白（如occludin和claudin-5）和細胞骨架蛋白actin的橋梁［9］。occludin是第一個被確定的定位于緊密連接的完整膜蛋白［10］，經(jīng)過4次跨膜形成兩個細胞外環(huán)，細胞外環(huán)與相鄰內(nèi)皮細胞的occludin細胞外環(huán)相互作用封閉細胞間縫隙［11］。盡管occludin在維持緊密連接完整性中的作用仍有爭議，但大多數(shù)研究者認為occludin的缺失會引起緊密連接開放［7，12］。這些緊密連接相關(guān)蛋白彼此之間存在多重聯(lián)系，不僅維持緊密連接的完整性，而且為腦內(nèi)皮提供結(jié)構(gòu)支持，如果這些蛋白發(fā)生紊亂將會直接影響緊密連接的完整性，進而改變血腦屏障的功能。本研究結(jié)果顯示BK降低了血腫瘤屏障微血管內(nèi)皮細胞緊密連接相關(guān)蛋白occludin和ZO-1mRNA的表達，我們的前期研究已經(jīng)證明BK能夠降低occludin和ZO-1的蛋白表達水平，說明BK能夠在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上調(diào)節(jié)occludin和ZO-1的表達。緊密連接相關(guān)蛋白occludin表達的減少可使其封閉細胞旁縫隙的能力缺失，引起緊密連接開放；ZO-1表達減少后則會引起occludin等跨膜蛋白從細胞骨架上解離，也可使occludin封閉細胞旁縫隙的能力缺失，引起緊密連接開放。這些結(jié)果說明BK能夠在不同水平上降低occludin和ZO-1的表達，通過細胞旁途徑開放血腫瘤屏障。

CREB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，具有廣泛而復雜的功能，在生理和病理條件下都發(fā)揮非常重要的作用［13］。CREB可被多種信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控，磷酸化的CREB是其活性形式，研究顯示CREB激活后可引起內(nèi)皮細胞緊密連接相關(guān)蛋白在DNA水平上發(fā)生改變，進而引起血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的破壞［6］，但CREB在BK調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄中的作用尚不清楚。研究顯示CREB參與了BK對人氣管平滑肌環(huán)氧化酶2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［14］，同時我們研究小組證明BK作用后能夠誘導C6膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)CREB蛋白的磷酸化［15］，因此推測BK可能通過激活CREB實現(xiàn)對腫瘤微血管內(nèi)皮細胞緊密連接相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)BK能夠引起腫瘤微血管內(nèi)皮細胞p-CREB蛋白表達的上調(diào)，降低CREB蛋白的表達，二者最明顯的變化均出現(xiàn)在BK作用15 min時，其變化時相與緊密連接相關(guān)蛋白occludin和ZO-1mRNA的變化時相相對應(yīng)，提示BK可能通過CREB途徑調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白mRNA的表達，進而開放緊密連接，增加血腫瘤屏障的通透性。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示BK能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白occludin和ZO-1的表達，核轉(zhuǎn)錄因子CREB可能參與了該過程。

［1］Black KL，Ningaraj NS.Modulation of brain tumor capillaries for enhanced drug delivery selectively to brain tumor［J］.Cancer Control，2004，11（3）：165-173.

［2］Inamura T，Black KL.Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors ［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1994，14（5）：862-870.

［3］Hashizume K，Black KL.Increased endothelial vesicular transport correlates with increased blood-tumor barrier permeability induced by bradykinin and leukotriene C4 ［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2002，61（8）：725-735.

［4］Sanovich E，Bartus RT，F(xiàn)riden PM，et al.Pathway across blood-brain barrier opened by the bradykinin agonist，RMP-7 ［J］.Brain Res，1995，705（1-2）：125-135.

［5］Liu LB，Xue YX，Liu YH，et al.Bradykinin increases blood-tumor barrier permeability by down-regulating the expression levels of ZO-1，occludin，and claudin-5 and rearranging actin cytoskeleton ［J］.J Neurosci Res，2008，86（5）：1153-1168.

［6］Cruzalegui FH，Bading H.Calcium-regulated protein kinase cascades and their transcription factor targets［J］.Cell Mol Life Sci，2000，57（3）：402-410.

［7］Bernacki J，Dobrowolska A，Nierwińska K，et al.Physiology and pharmacological role of the blood-brain barrier［J］.Pharmacol Rep，2008，60（5）：600-622.

［8］BallabhP，BraunA，NedergaardM.Theblood-brainbarrier：an overview.Structure，regulation，andclinicalimplications［J］.NeurobiolDis，2004（1），16：1-13.

［9］Fanning AS，Anderson JM.Zonula occludens-1 and-2 are cytosolic scaffolds that regulate the assembly of cellular junctions［J］.Ann N Y Acad Sci，2009，1165：113-120.

［10］F觟ster C.Tight junctions and the modulation of barrier function in disease［J］.Histochem Cell Biol，2008，130（1）：55-70.

［11］Wong V，Gumbiner BM.A synthetic peptide corresponding to the extracellular domain of occludin perturbs the tight junction permeability barrier［J］.J Cell Bio，1997，136（2）：399-409.

［12］Kondoh M，Yoshida T，Kakutani H，et al.Targeting tight junction proteins-significance for drug development［J］.Drug Discov Today，2008，13（3-4）：180-186.

［13］Tanaka K.Alteration of second messengers during acute cerebral ischemia-adenylate cyclase，cyclic AMP-dependent protein kinase，and cyclic AMP response element binding protein［J］.Prog Neurobiol，2001，65（2）：173-207.

［14］Nie M，Pang L，Inoue H，et al.Transcriptional regulation of cyclooxygenase 2 by bradykinin and interleukin-1beta in human airway smooth muscle cells：involvement of different promoter elements，transcription factors，and histone h4 acetylation［J］.Mol Cell Biol，2003，23（24）：9233-9244.

［15］王振華，薛一雪，劉麗波，等.緩激肽誘導膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化的實驗研究［J］.中國藥理學通報，2006，22（12）：1444-1447.