胰島素抵抗大鼠肝臟組織PERK和p-PERK的表達(dá)及意義

林志楠，羅紅飛，都健，裴麗娜，劉佳，郭寧寧，張克瑩

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽(yáng) 110001）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）發(fā)病的兩個(gè)關(guān)鍵因素是胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島β細(xì)胞功能障礙［1］。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在IR的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［2］。本研究通過(guò)高脂喂養(yǎng)并經(jīng)高血漿胰島素-正常血糖鉗夾技術(shù)評(píng)估胰島素抵抗大鼠模型，在此基礎(chǔ)上采用Western blot方法檢測(cè)大鼠肝臟組織ERS標(biāo)志分子PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)激酶（PKR-like endoplasmic reticulum regulating kinase，PERK） 和磷酸化 PERK（phosphorylated PKR like endoplasmic reticulum regulating kinase，p-PERK）蛋白表達(dá)水平的變化，探討IR發(fā)生的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 胰島素抵抗大鼠模型的建立

具體方法參照文獻(xiàn)［3］。SPF級(jí)4周齡雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量80～120 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常飲食組（NC組，n=15）和高脂飲食組（HF組，n=15）。大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)中，溫度控制在（23±2）℃，濕度控制在60%左右，明暗交替周期為12 h。NC組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，作為對(duì)照組。HF組給予高脂飼料喂養(yǎng)，建立胰島素抵抗大鼠模型。每周固定時(shí)間監(jiān)測(cè)大鼠體質(zhì)量和尾靜脈血糖。10周后，每組隨機(jī)抽取5只行高血漿胰島素-正常血糖鉗夾（hyperinsulinemic-euglycemic clamp，HEC）以評(píng)估胰島素抵抗大鼠模型建立。基礎(chǔ)飼料配方參照文獻(xiàn)［3］。高脂飼料配方：100g高脂飼料含基礎(chǔ)飼料60 g、新鮮豬油30 g、低脂奶粉10 g；熱量比：蛋白質(zhì)14%，脂肪59%，碳水化合物27%。

1.2 高血漿胰島素-正常血糖鉗夾試驗(yàn)

具體方法參照文獻(xiàn)［4］。左頸總動(dòng)脈接肝素生理鹽水注射器，右股靜脈接三通管后分別接裝有40 mU/mL的人胰島素注射液（丹麥諾和諾德公司產(chǎn)品）和10%葡萄糖注射液的50 ml注射器，再接微量輸液泵。靜置30 min后，頸總動(dòng)脈取血1 ml測(cè)基礎(chǔ)血糖和基礎(chǔ)胰島素。首先輸注胰島素，輸注率1.67 mU·kg-1·min-1，每 5 min 頸動(dòng)脈取血 1 滴測(cè)血糖，當(dāng)血糖>（基礎(chǔ)值±0.5）mmol/L時(shí)開(kāi)始輸注葡萄糖，輸注率從 4～6 mg·kg-1·min-1開(kāi)始。每 5 min 測(cè)血糖1次，調(diào)整葡萄糖輸注率（glucose infusion rate，GIR），使血糖保持在（基礎(chǔ)值±0.5）mmol/L，連續(xù) 3次血糖都在上述范圍內(nèi)，鉗夾形成。實(shí)驗(yàn)共計(jì)約2 h，計(jì)算60～120 min的平均GIR，評(píng)價(jià)胰島素的敏感性。頸動(dòng)脈血樣4℃，3 000g，離心15 min，分離血清置－80℃冰箱凍存。

1.3 標(biāo)本采集

NC組和HF組未做鉗夾的20只大鼠禁食16 h，經(jīng)10%水合氯醛（0.3 mg/kg）腹腔內(nèi)麻醉后，腹主動(dòng)脈穿刺取血約4 ml，4℃、3 000g、離心15 min后，分離血清置-80℃冰箱凍存。肝臟組織剪成約100 mg大小的組織塊，剔除血管和其他結(jié)締組織，清洗后蘸干，放入1.5 ml EP管中于-80℃冰箱中凍存。

1.4 Western blot方法測(cè)定肝臟組織PERK和p-PERK蛋白

取肝臟組織100 mg，加入1 ml蛋白裂解液，超聲勻漿靜置30 min后，4℃，12 000g，離心30 min，取上清，BCA法蛋白定量。取含總蛋白30 μg的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h后依次加入一抗（兔抗大鼠PERK單克隆抗體，1∶500稀釋?zhuān)⒍梗ɡ备^(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔單克隆抗體，1∶5 000稀釋?zhuān)茨ず笥迷鰪?qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯像，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。檢測(cè)p-PERK蛋白水平時(shí)一抗為兔抗大鼠p-PERK單克隆抗體（1∶1 000稀釋?zhuān)篂槔备^(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體（1∶5 000稀釋?zhuān)?/p>

1.5 血清胰島素水平檢測(cè)

取100 μl凍存的血清，應(yīng)用大鼠胰島素ELISA試劑盒（R&D公司），依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)基礎(chǔ)狀態(tài)下的血清胰島素水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，正態(tài)分布資料以±s表示，組間差異比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠一般情況比較

喂養(yǎng)10周后，NC組和HF組大鼠體質(zhì)量和基礎(chǔ)血糖水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HF組基礎(chǔ)胰島素水平高于NC組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HF組血清甘油三酯水平高于NC組，且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠一般情況比較（n，±s）Tab.1 Comparison ofgeneralconditions between 2 groups（n，±s）

表1 兩組大鼠一般情況比較（n，±s）Tab.1 Comparison ofgeneralconditions between 2 groups（n，±s）

NC，normal diet group；HF，high-fat diet group；BM，body mass；TG，triglyceride；BBI，baseline blood insulin；BBG，baseline blood glucose，Compared with NC group，1）P<0.01，2）P<0.05.

Group n BM（g） TG（mmol/l）NC 10 303.13±33.37 0.14±0.07 BBI（mmol/l） BBG（mmol/l）13.94±2.97 6.08±0.34 HF 10 303.87±20.67 0.29±0.111） 15.87±1.972） 6.58±0.81

2.2 兩組大鼠高血漿胰島素-正常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

HF組大鼠60～120 min的平均葡萄糖輸注率（GIR60～120）低于NC組，且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.90±0.15 mg·kg-1·min-1vs 4.97±0.68 mg·kg-1·min-1，P<0.01）。見(jiàn)圖 1。

2.3 兩組大鼠肝臟組織PERK，p-PERK蛋白的表達(dá)水平比較

NC組和HF組大鼠肝臟組織PERK表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HF組大鼠肝臟組織p-PERK表達(dá)水平及p-PERK/PERK高于NC組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2和圖2。

表2 兩組大鼠肝臟PERK、p-PERK蛋白表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison ofthe levels ofPERKand p-PERKprotein in the livers between 2 groups

3 討論

IR是指胰島素作用的靶組織（主要是骨骼肌、肝臟和脂肪組織）對(duì)外周胰島素的反應(yīng)性和敏感性下降［5］。近年來(lái)提出了IR的炎癥病因?qū)W說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)和炎癥-氧化應(yīng)激-炎癥學(xué)說(shuō)等，但引發(fā)細(xì)胞應(yīng)激的起源尚不清楚。2005年，日本學(xué)者Nakatani等［6］首次報(bào)道了ERS參與IR和糖尿病的發(fā)病。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白和膜蛋白合成與翻譯后修飾、多肽鏈正確折疊與裝配的重要場(chǎng)所，對(duì)應(yīng)激極為敏感。持續(xù)的ERS發(fā)生在胰島素作用的靶組織可以引起IR。Ozcan等［7］建立了高脂飲食誘導(dǎo)和ob/ob基因型肥胖小鼠模型，發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠肝臟組織中ERS標(biāo)志分子PERK、eIF2α和JNK的磷酸化水平等顯著升高。Kaneto等［8］發(fā)現(xiàn)ERS可通過(guò)IRE-1α-JNK信號(hào)通路減弱Akt的磷酸化和促進(jìn)IRS-1絲氨酸磷酸化而致IR。但ERS導(dǎo)致IR的具體機(jī)制尚未完全明確。

PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的感應(yīng)蛋白，在ERS時(shí)PERK磷酸化而活化，活化的PERK一方面通過(guò)磷酸化eIF2α，減少蛋白合成而緩解ERS；另一方面也能選擇性地增加轉(zhuǎn)錄因子ATF4及CHOP的表達(dá)而激活其下游通路［9］。本研究結(jié)果顯示HF組大鼠基礎(chǔ)胰島素水平高于NC組（P＜0.05），并且HF組大鼠GIR60～120低于NC組（P＜0.01），證實(shí)IR 大鼠模型成功建立；肝臟組織PERK和p-PERK蛋白的表達(dá)上，HF組大鼠肝臟組織PERK的表達(dá)水平與NC組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而p-PERK表達(dá)顯著升高（P＜ 0.05），這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7］。另外 HF 組大鼠肝臟組織p-PERK/PERK的比值也升高（P＜0.05），證實(shí)在高脂飲食誘導(dǎo)的IR大鼠模型中存在ERS。在本研究中PERK的表達(dá)兩組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異可能是因?yàn)镻ERK在生理狀態(tài)下也表達(dá)，而在ERS時(shí)表達(dá)水平升高，但這不是ERS特征性的變化。ERS時(shí)一部分PERK通過(guò)磷酸化而活化，從而激活其下游的通路。采用p-PERK/PERK的比值可以消除總PERK蛋白變化的干擾。本研究高脂飼料配方中新鮮豬油的主要成分是飽和脂肪酸，10周高脂飼料喂養(yǎng)后，與NC組相比，HF組大鼠體質(zhì)量和基礎(chǔ)血糖無(wú)明顯差異（P＞0.05），而血清TG水平顯著升高（P＜0.01），HF組大鼠肝臟組織p-PERK蛋白的表達(dá)水平也明顯升高（P＜0.05），并且基礎(chǔ)胰島素水平也顯著升高（P＜0.05）。這些結(jié)果表明高脂喂養(yǎng)可能通過(guò)脂毒性造成肝臟組織ERS，從而引起IR。有研究［10］顯示，營(yíng)養(yǎng)信號(hào)和ERS可以激活PERK，活化的PERK通過(guò)激活重要的炎癥激酶c-Jun氨基端激酶（C-Jun N-terminal kinase，JNK）而調(diào)節(jié)胰島素的活性。PERK也可以直接作用于胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）而改變胰島素的活性。但ERS通過(guò)PERK通路介導(dǎo)IR的具體機(jī)制尚未明確。

綜上所述，高脂喂養(yǎng)可以造成肝臟組織ERS，其可能通過(guò)IRE-1α-JNK信號(hào)通路和PERK-JNK/IRS信號(hào)通路導(dǎo)致IR的發(fā)生，但ERS導(dǎo)致IR的具體機(jī)制尚未完全明確，有待于進(jìn)一步研究。

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