衣霉素抑制細胞周期蛋白D1表達而強化TRAIL誘發凋亡的實驗研究

解繼勝，張海燕，都鎮先，鄧娓娓，王華芹

（1.右江民族醫學院 組織胚胎學教研室，廣西 百色 533000；2.中國醫科大學 附屬第一醫院老年病干診科；3.中國醫科大學 附屬第一醫院內分泌科，沈陽 110001；4.中國醫科大學 基礎醫學院生化與分子生物學教研室，沈陽 110001）

近來研究顯示［1］腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）能誘導許多腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞基本沒有影響，因而可能成為很有前景的抗癌藥。但甲狀腺惡性腫瘤細胞對TRAIL的敏感性具有相當的異質性［2，3］。因此，TRAIL 凋亡誘導增敏劑的發現將能有效擴展TRAIL的腫瘤治療效應。衣霉素是一種天然抗生素，阻止細胞內N端連接寡糖類生物合成的第一步，曾用于TRAIL自發性耐藥前列腺癌和獲得性耐藥大腸癌治療［4］，但其增加TRAIL抗腫瘤作用分子機制尚未闡明。為此，本研究以人甲狀腺未分化癌細胞為對象，通過TRAIL單用及聯用衣霉素，探討衣霉素對TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡的增敏效應及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑

甲狀腺未分化癌ARO細胞株和正常甲狀腺上皮細胞株HTori-3分別由美國標準生物品收藏中心和歐洲標準生物品收藏中心提供。衣霉素和可溶性TRAIL分別購于Sigma公司和R&D公司。以下抗體用于蛋白印記分析：γ-tubulin（Sigma公司），phospho S249 Rb（Abcam 公司），cyclin D1（Santa Cruz生物工程公司）。ECL試劑盒（英國Amersham生命科學公司）；脂質體2000轉染試劑（Invitrogen公司）。

1.2 細胞培養及分組

2種細胞均于含10%胎牛血清1640（sigma公司）培養基中、37℃、5%CO2、飽和濕度下培養，2～3 d傳代1次，均選用對數生長期細胞進行實驗。按干預因素將甲狀腺未分化癌細胞ARO分為TRAIL組、衣霉素組、TRAIL+衣霉素組（聯合用藥組）；同時以正常甲狀腺上皮細胞株HTori-3為對照（對照組）。單藥組為向細胞中分別加入 0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 μg/ml TRAIL 和 0，1，2.5，5，10，20 μg/mL 衣霉素作用24或48 h；聯合用藥組為用5 μg/mL衣霉素預處理 24 h 后，應用 0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 μg/ml TRAIL處理細胞24 h。

1.3 細胞凋亡檢測

按照廠商說明利用膜聯蛋白-PE凋亡檢試劑盒I（BD Bioscience）檢測細胞死亡，然后經熒光活性細胞掃描（FACScan）流式細胞儀分析（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ）。每次試驗至少計數 500 個細胞核，所有試驗均進行3次。

1.4 流式細胞計數法

細胞經70%乙醇固定，PBS再水化，碘化丙錠（Sigma）染色，然后利用流式細胞計數法（FACScan，Becton Dickinson）分析DNA容量。細胞周期分布通過ModFit軟件（Verity Software House）分析。流式細胞儀對各組細胞DNA含量進行分析，2N峰代表G0/G1期，交叉峰代表S期，4N峰代表G2/M期。

1.5 Western blot檢測多種蛋白表達

收集各組細胞，裂解破碎離心后，測上清蛋白濃度，用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和電轉移法轉至硝酸纖維素（PVDF）膜上，以5%脫脂奶粉TBST封閉后，依次加入一抗phospho S249 Rb，cyclin D1；以γ-tubulin為內對照，4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，然后參照ECL試劑盒說明進行化學發光顯像。

1.6 微小RNA干擾（siRNA）

本實驗應用的微小干擾RNA序列如下：抗細胞周期蛋白D1 的 siRNA（sicycD1），GUUCAUUUCCAAUCCGCCC；亂序的無意義 siRNA（scramble，與任何已知基因無同源性，作為對照），CCGUAUCGUAAGCAGUACU；抗細胞周期蛋白D1的位點錯配（下劃線序列）siRNA（simutcycD1，用于確認 sicycD1的特異性），GUUCAUUUGGAAUCCGCCC。按照試劑盒說明利用陽離子脂質體2000轉染試劑將siRNA轉染至細胞中。

1.7 構建細胞周期蛋白D1穩定過表達ARO細胞系

編碼細胞周期蛋白D1的互補DNA（complementary DNA，cDNA）是利用PCR方法源于人腦cDNA 文庫（Invitrogen，Carlsbad，CA），然后亞克隆至真核表達質粒pcDNA3。該構建物經DNA測序核實無誤，按照試劑盒說明利用陽離子脂質體2000轉染試劑轉染至細胞中。對照細胞用pcDNA3-Flag轉染。轉染細胞用G418（800 mg/mL）培養基進行篩選培養，得到陽性克隆后，進一步擴增培養，利用細胞周期蛋白D1或Flag抗體通過免疫印跡分析鑒定相關陽性蛋白表達細胞。

2 結果

2.1 衣霉素作用ARO對TRAIL的敏感性的影響

結果發現即使大劑量TRAIL（2 mg/ml）作用48 h，ARO細胞凋亡率僅為12%（圖1A），表明ARO細胞抵抗TRAIL的抗腫瘤作用。20 mg/ml的衣霉素單獨用藥，ARO細胞凋亡率為11.5%（圖1B）。然而，5 mg/ml衣霉素預處理24 h后，明顯增加TRAIL誘導的ARO細胞凋亡，濃度為2 mg/ml時，ARO細胞凋亡率可高達56.5%，與TRAIL組、衣霉素組相比具有統計學差異（P<0.01）（圖 1C）。TRAIL、衣霉素單藥及兩者聯合用藥對HTori-3的生存均無明顯影響，細胞凋亡率<5%（圖1D）。

2.2 衣霉素對ARO細胞G1向S期的進展影響

流式細胞儀檢測顯示對照組中G0/G1期細胞比率為31%，而TRAIL單藥組G0/G1期細胞比率為34%，兩組間沒有統計學差異（P>0.05）；衣霉素組與聯合用藥組中G0/G1期細胞比率分別為51%和58%，兩組間亦沒有統計學差異，但與對照組和TRAIL組相比具有統計學差異（P<0.01）。這提示衣霉素可明顯增加G0/G1期細胞，誘導G1/S期細胞阻滯。

2.3 衣霉素對ARO細胞中細胞周期蛋白D1和磷酸化Rb蛋白表達的影響

結果顯示衣霉素作用于甲狀腺癌ARO細胞，減少細胞周期蛋白D1蛋白表達的水平。與細胞周期蛋白D1促進細胞周期從G1期向S期進展的功能相一致，衣霉素導致細胞周期蛋白D1減少后也引起磷酸化蛋白Rb的顯著下調（圖2）。

2.4 CyclinD1微小RNA干擾細胞對TRAIL敏感性的影響

sicycD1有效封閉了細胞周期蛋白D1的表達，與衣霉素處理結果相似；而對照組及抗細胞周期蛋白D1的位點錯配，即simutcycD1組中cyclinD1的表達無明顯變化（圖3）。與對照組及simutcycD1組（約50%）相比，sicycD1及衣霉素組中的細胞生存率顯著下降，可達20%左右。

2.5 細胞周期蛋白D1過表達對衣霉素增敏TRAIL作用的影響

我們首先建立了細胞周期蛋白D1穩定過表達ARO細胞系（圖4A）。細胞周期蛋白D1過表達明顯降低衣霉素的增敏作用（圖4B）。

3 討論

本研究檢測TRAIL單獨用藥對ARO細胞的毒性作用，與先前報道相似［5］，ARO細胞顯示了對TRAIL治療的抵抗作用。TRAIL誘導甲狀腺癌凋亡的效應各異和許多腫瘤本身或通過治療而獲得的對TRAIL誘導凋亡的抵抗，限制了TRAIL治療腫瘤的療效。衣霉素已被用于增敏前列腺癌的自發TRAIL抵抗和結腸癌獲得性的TRAIL抵抗。先前報道［4］證實衣霉素通過上調CHOP及其隨后的DR5表達而增敏前列腺癌的TRAIL效應，但我們先前用衣霉素處理的甲狀腺癌ARO中未見到上調的DR5表達［6］。本研究結果證實衣霉素通過下調細胞周期蛋白D1表達而增敏了甲狀腺癌細胞ARO對TRAIL的效應。

有報道證實衣霉素可阻斷G1/S細胞周期進程［7，8］，這與本實驗結果相一致，并且先前研究［9～11］提示能夠阻滯細胞停留在細胞周期G1期的藥物能夠提高TRAIL誘導的細胞毒性。細胞周期蛋白D1是一種細胞周期調節因子，據報道［12］其通常過度表達于甲狀腺癌，更常見于未分化甲狀腺癌。細胞周期蛋白D1表達受抑使細胞停滯于G1期，不能進入細胞有絲分裂的S期，進而導致腫瘤細胞增殖受抑，細胞凋亡。本研究發現衣霉素處理癌細胞后出現細胞周期蛋白D1的表達下調。細胞周期蛋白D1表達下調在衣霉素增敏TRAIL誘導細胞凋亡中的重要作用，亦被我們通過沉默細胞周期蛋白D1可增敏TRAIL的凋亡效應的觀察所證實；反之，強制細胞周期蛋白D1過表達可降低衣霉素介導的TRAIL增敏效應。因此，認為細胞周期蛋白D1可能是甲狀腺癌TRAIL抵抗的關鍵調節者之一，衣霉素的TRAIL增敏效應可能至少部分源于通過衣霉素介導的細胞周期蛋白D1表達受抑。鑒于許多甲狀腺癌中細胞周期蛋白D1均被擴增和過表達，因此這些腫瘤可能更適于衣霉素和TRAIL的聯合治療。

我們的研究顯示衣霉素和TRAIL聯合處理對甲狀腺未分化癌ARO細胞產生顯著的細胞毒作用，而對分化的甲狀腺上皮細胞HTori-3無顯著影響。因此，對于TRAIL抵抗的甲狀腺癌，TRAIL聯合亞毒性劑量的衣霉素治療可能會成為潛在的有效策略，但尚需大規模的動物實驗和臨床前期試驗的進一步證實。

［1］Pan G，Ni J，Wei YF，et al.An antagonist decoy receptor and a death domain-containingreceptorforTRAIL［J］.Science，1997，277（5327）：815-818.

［2］Mitsiades N，Poulaki V，Tseleni-Balafouta S，et al.Thyroid carcinoma cells are resistant to FAS-mediated apoptosis but sensitive to tumor necrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand［J］.CancerRes，2000，60（15）：4122-4129.

［3］Wang SH，Mezosi E，Wolf JM，et al.IFNgamma sensitization to TRAIL-induced apoptosis in human thyroid carcinoma cells by upregulating Bak expression［J］.Oncogene，2004，23（4）：928-935.

［4］Shiraishi T，Yoshida T，Nakata ST，et al.Tunicamycin enhances tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis in human prostate cancer cells［J］.Cancer Res，2005，65（14）：6364-6370.

［5］Du ZX，Wang HQ，Zhang HY，et al.Involvement of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in tumor necrosis factor-related apoptosisinducingligand-mediateddeathofthyroidcancercells［J］.Endocrinology，2007，148（9）：4352-4361.

［6］Zhang HY，Du ZX，Liu BQ，et al.Tunicamycin enhances TRAIL-induced apoptosis by inhibition of cyclin D1 and the subsequent downregulation of survivin［J］.Exp Mol Med，2009，41（5）：362-369.

［7］Brewer JW，Hendershot LM，Sherr CJ，et al.Mammalian unfolded protein response inhibits cyclin D1 translation and cell-cycle progression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（15）：8505-8510.

［8］Hoozemans JJ，Stieler J，van Haastert ES，et al.The unfolded protein response affects neuronal cell cycle protein expression：implications for Alzheimer's disease pathogenesis［J］.Exp Gerontol，2006，41（4）：380-386.

［9］Kim EH，Kim HS，Kim SU，et al.Sodium butyrate sensitizes human glioma cells to TRAIL-mediated apoptosis through inhibition of Cdc2 andthesubsequentdownregulationofsurvivinandXIAP［J］.Oncogene，2005，24（46）：6877-6889.

［10］Kim EH，Kim SU，Choi KS.Rottlerin sensitizes glioma cells to TRAIL-induced apoptosis by inhibition of Cdc2 and the subsequent downregulation of survivin and XIAP［J］.Oncogene，2005，24（5）：838-849.

［11］Lu M，Kwan T，Yu C，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists promote TRAIL-induced apoptosis by reducing survivinlevelsviacyclinD3repressionandcellcyclearrest［J］.JBiol Chem，2005，280（8）：6742-6751.

［12］Erickson LA，Yousef OM，Jin L，et al.p27kip1 expression distinguishes papillary hyperplasia in Graves'disease from papillary thyroid carcinoma［J］.Mod Pathol，2000，13（9）：1014-1019.