胃腸道間質瘤中PTEN、蛋白激酶B與轉錄因子家族NF-κB、bcl-2關系的研究

趙毅，馮勇，王強，趙瀅，鄧鑫，張天彪，李異玲

（中國醫科大學 1.附屬盛京醫院胃腸外科，沈陽 110004；2.基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，沈陽 110001；3.附屬第一醫院消化內科，沈陽 110001）

胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，占胃腸道腫瘤的1%～4%，每年發病率約2/10萬［1］。該腫瘤具有惡變潛能，對GIST的良惡性判斷和預后因素尚無統一認識。

腫瘤發生中細胞信號傳導通路的異常是細胞惡變的主要原因之一。近年來發現，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和其下游分子蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB 或 Akt）所組成的信號通路在腫瘤的發生、發展、治療及轉歸中發揮重要作用［2］。磷酸化抑癌基因（phromosometen，PTEN）是一種腫瘤抑制基因，是最易發生突變的靶點基因之一。PTEN基因的突變，可以激活PI3K/Akt途徑，使絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt脫磷酸化而活化，活化的Akt通過阻止從線粒體釋放細胞色素C和使具有抗凋亡作用的轉錄因子NF-κB（nuclear factor-κB）失活，導致細胞不受各種凋亡刺激的作用而發生腫瘤。

在GIST中，隨著惡性潛能的增加，凋亡因子過表達可能扮演一個重要角色。本文通過觀察GIST組織標本中Akt、PTEN、NF-κB以及B細胞淋巴瘤/白血病2（bcl-2）表達水平的變化，探討它們與GIST臨床病理特征及預后的相關性，以此揭示其在GIST發生發展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇臨床病理資料完整、隨訪結果確切的中國醫科大學附屬盛京醫院1990年2月至2007年2月手術切除、病理證實的GIST新鮮組織標本124例。男性64例，女性60例，年齡9～79歲，平均54.6歲。腫瘤發生于胃62例（50.0%）、小腸28例（22.6%）、結直腸14例（11.3%）、食管 9例（7.3%）、胃腸道外11例（8.9%）（其中網膜4例、腸系膜4例、后腹膜3例）。另取腫瘤旁組織作為對照。

GIST的診斷標準：常規形態符合GIST診斷要點，免疫組化CD117（＋）確診；或者常規形態符合GIST 診斷要點，CD117（－）CD34（＋） 確診；或者CD117（－）CD34（－），并且平滑肌肌動蛋白（smooth muscle actin，SMA）、結蛋白（desmin）、神經脊突細胞抗原（S-100）蛋白均陰性，排除平滑肌源性和神經源性腫瘤，病理組織學形態符合GIST而納入本研究。其中CD117（＋）113例（91.1%）、CD34（＋）109例（87.9%）。

依據Fletcher等提出的GIST生物學行為分級標準進行分級（NIH分級）：腫瘤直徑＜2 cm和核分裂象＜5/50 HPF為極低度侵襲危險性（Ⅰ級）；腫瘤直徑2～5 cm和核分裂象＜5/50 HPF為低度侵襲危險性（Ⅱ級）；腫瘤直徑5～10 cm和核分裂象＜5/50 HPF或腫瘤＜5 cm和核分裂象6～10/50 HPF為中度侵襲危險性（Ⅲ級）；腫瘤直徑>5 cm和核分裂象>5/50 HPF或腫瘤>10 cm和核分裂象>10/50 HPF為高度侵襲危險性（Ⅳ級）。

本研究124例GIST中、除9例因其他原因死亡外，其余115例隨訪資料完整，隨診時間10～204個月，平均52個月。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 檢測AKT、PTEN、NF-κB、bcl-2在GIST中的mRNA水平：選擇特異性引物序列分別為：Akt上游序列 5′-TGAGCGACGTGGCTATTG-3′，下游序列 5′-CAGTCTGGATGGCGGTTG-3′，目的片段484 bp；PTEN上游序列5′ -CAGAGCGAGGGGCATCAG-3′，下游序列 5′-GCAG GAAATCCCATAGCAATAA-3′，目的片段 460 bp；NF-κB上游序列 5′-TGCCGAGTGAACCGAAAC-3′，下游序列 5′TGGTGCTCAGGGATGACG-3′，目的片段453bp；bcl-2上游序列 5′-TGGGAGAACAGGGTACG ATA-3′，下游序列 5′-CCACCGAACTCAAAGAAGG-3′，目的片段278 bp；內參照β-actin上游序列5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3′，下游序列 5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3′，目的片段472 bp。PCR反應條件為95℃變性1 min，52℃～57℃退火2 min，72℃延伸10 min，所有的標本都經過3次重復檢測。將PCR反應產物在2%的瓊脂糖溴化乙錠凝膠上電泳，采用UVP凝膠成像分析系統掃描測定PCR產物帶的密度，將各目的基因產物帶所測得的密度值與內對照β-actin產物帶的密度值進行比較，各目的基因表達水平以與β-actin內對照比值的形式來表示。

1.2.2 Western blot 檢測 PTEN、pAkt、NF-κB、bcl-2在GIST及對照組的蛋白表達情況：0.5 g GIST加入1 ml細胞裂解緩沖液（Cell Signaling Technology，美國）及1 mmol的PMSF（苯甲基磺酰氟）勻漿。按常規步驟提取蛋白，測定蛋白濃度。電泳前，加入SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5 min，離心后上樣，12%SDS-PAGE分離，然后將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，一抗孵育，堿性磷酸酶耦聯的IgG作為二抗，堿性磷酸酶底物顯色。一抗購自美國Santa Cruz公司，二抗購自中山金橋生物公司。

1.3 統計學分析

應用SPSS 13.0軟件包進行數據分析，計量數據以±s表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，相關分析采用簡單線性相關，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Akt、PTEN在GIST中的mRNA表達水平的變化

AktmRNA表達水平隨NIH分級上調，其中高、中危腫瘤組比較差異無統計學意義，其余各組之間比較差異有統計學意義（P<0.05）；Akt的陽性表達率與性別、年齡、組織學類型無關，與腫瘤侵襲轉移和黏膜受侵顯著相關。PTENmRNA表達水平隨NIH分級下調（P<0.05），PTEN的缺失率隨腫瘤惡性程度的增加而增高；PTEN的陽性表達率與性別、年齡、組織學類型無關，與腫瘤侵襲轉移和黏膜受侵關系密切。見圖1。

2.2 NF-κB、bcl-2在GIST中的mRNA表達水平變化

NF-κBmRNA表達水平隨NIH分級上調，且腫瘤惡性度越高，臨床分期越晚，表達水平增加程度越重，與腫瘤的侵襲轉移、黏膜受侵密切相關，而與年齡、性別、組織學類型無關；bcl-2mRNA水平與NIH分級、黏膜受侵有關（P<0.05），而與年齡、性別、組織學類型、轉移復發及周圍組織浸潤無關。各指標與臨床病理特征之間的關系見表1。

2.3 pAkt、PTEN蛋白在GIST中的表達

各指標蛋白表達水平與mRNA水平基本一致，但pAkt蛋白在GIST組織中的表達水平明顯增高（圖 2，表 2）。

表1 GIST中NF-κB、bcl-2mRNA的表達與臨床病理特征的關系（±s）Tab.1 The relationship between the mRNA expression of NF-κB，bcl-2and the clinicopathological characteristics of GIST（±s）

表1 GIST中NF-κB、bcl-2mRNA的表達與臨床病理特征的關系（±s）Tab.1 The relationship between the mRNA expression of NF-κB，bcl-2and the clinicopathological characteristics of GIST（±s）

1）P<0.01，2）P<0.05 vs control group；3）P<0.01，4）P<0.05 compare between groups.

Clinicopathological characteristics n NF-κB bcl-2 Gender Male 64 0.805±0.0892） 1.236±0.1292）Female 60 0.780±0.1012） 1.184±0.1982）Age（year）≥55 70 0.783±0.1102） 1.193±0.1312）＜ 55 54 0.804±0.9652） 1.203±0.1562）Histological type Epithelioid 28 0.783±0.0942） 1.189±0.1432）Shuttlelike 73 0.791±0.0792） 1.206±0.1572）Mixed type 23 0.804±0.0882） 1.195±0.1432）Tumor invasion No 84 0.748±0.0822） 1.198±0.1442）Yes 40 0.855±0.0941），4） 1.195±0.1551）Paratumor tissue 124 0.565±0.085 0.886±0.133 NIH Lower risk 6 0.641±0.1032），4） 0.898±0.1442），4）Low risk 20 0.735±0.0812），3） 1.067±0.1171），3）Middle risk 37 0.786±0.0941），4） 1.174±0.1412），4）High risk 61 0.843±0.1012），4） 1.314±0.1582），4）Mucosa invasion No 79 0.708±0.0991） 1.059±0.1212）Yes 34 0.819±0.1102），4） 1.309±0.1451），4）

表2 GIST中pAkt和PTEN蛋白表達水平與NIH分級的關系（±s）Tab.2 The relationship between the protein expression of pAkt，PTEN and NIH classification（±s）

表2 GIST中pAkt和PTEN蛋白表達水平與NIH分級的關系（±s）Tab.2 The relationship between the protein expression of pAkt，PTEN and NIH classification（±s）

Compare with paratumor tissue，1）P<0.01，2）P<0.05，Compare between groups，3）P<0.01，4）P<0.05.

Classification n pAkt PTEN Paratumor tissue 124 72.13±3.25 161.16±5.64 NIH Lower risk 6 93.64±2.182），4） 148.72±3.332），4）Low risk 20 115.16±3.832），4） 114.28±3.872），4）Middle risk 37 142.52±4.732），3） 73.24±1.722），3）High risk 61 180.55±4.781），4） 60.12±1.782），4）

2.4 相關性分析

本研究124例GIST組織中，PTEN與pAkt蛋白陽性表達之間呈顯著負相關（r＝-0.386，P=0.024）。Akt和NF-κB、bcl-2的mRNA表達之間呈顯著正相關（r＝0.192，P=0.034；r＝0.368，P=0.012）。NF-κB和bcl-2的mRNA表達之間呈顯著正相關（r＝0.356，P=0.02）。

3 討論

Akt是信號轉導途徑中的重要蛋白激酶，它是PI3K下游作用的靶蛋白，是PI3K/Akt信號轉導通路的核心，其持續活化與腫瘤的發生發展密切相關［3］。在GIST中，隨著腫瘤惡性度的增加，Akt活性增高，活化的Akt可以直接磷酸化抑制KappaB蛋白激酶 a （inhibit KappaB kinase a，IKKa），使抑制KappaB蛋白激酶（inhibit KappaB kinase，IKK）激活，調節NF-κB活性。現已證實，Akt/PKB對于IKK介導的抑制因子 KappaB（inhibit KappaB，I-κB）的降解和NF-κB的激活是腫瘤發生發展必需的［4］。在對人類腫瘤PTEN基因缺失或突變的調查中發現，PTEN缺失發生在廣泛的人類腫瘤中［5，6］，PTEN是迄今發現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，可以通過控 制 活 化 的 磷 脂 酰 3，4，5-三 磷 酸 肌 醇（phophatidyl3，4，5-triphosphoinositol，PIP3） 來 調 控Akt的活性。PTEN能夠抑制PIP3激酶的磷酸化作用，阻斷Akt及其下游激酶的活性，引起細胞凋亡。

本研究發現AktmRNA表達水平隨GIST NIH分級上調，各組之間比較，除高、中危腫瘤組之間外，差異均有統計學意義；Akt的陽性表達率與性別、年齡、組織學類型無關，與腫瘤侵襲轉移和黏膜受侵顯著相關，提示Akt的過表達促進了GIST的侵襲轉移。PTENmRNA表達水平隨NIH分級下調，隨著腫瘤惡性程度的增加，PTEN的缺失率也逐漸增高；PTEN的陽性表達率與性別、年齡、組織學類型無關，與腫瘤侵襲轉移和黏膜受侵關系密切。進一步提示PTEN蛋白的缺失與GIST發生發展的關系密切。Western blot實驗的結果顯示，各指標蛋白水平的表達變化與mRNA水平基本一致。PTEN的表達與Akt的表達呈負相關，提示在GIST中PTEN的失活導致Akt的活化，從而導致腫瘤細胞逃避各種凋亡刺激，造成腫瘤發生發展。活化的pAkt蛋白在GIST組織中的表達水平明顯增高。這是由于在GIST組織中pAkt蛋白表達增高是蛋白翻譯和（或）翻譯后水平而非基因轉錄水平上調的結果。

NF-κB在腫瘤凋亡的調控中起關鍵性作用，抑制腫瘤細胞NF-κB的活性可引起腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的生長［7］。本研究結果顯示，NF-κBmRNA水平隨NIH分級升高而上調，且腫瘤惡性度越高，臨床分期越晚其上調程度越大，因而其表達水平可間接反映GIST的惡性程度。且NF-κB與腫瘤的侵襲轉移、黏膜受侵密切相關，而與年齡、性別、組織學類型無關。

活化的Akt能磷酸化bcl-2關聯的死亡啟動子（bcl-2 associated death promoter，BAD），BAD 通過磷酸化bcl-2家族而抑制凋亡。過度激活的Akt使細胞失去凋亡能力［8］。而NF-κB除可通過調控凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protein，IAP）等細胞因子的表達外，還可通過誘導和上調bcl-2家族蛋白發揮抑制凋亡作用［9］。由于bcl-2啟動子上存在NF-κB 的特異性結合位點［10］，被 Akt激活的 NF-κB 可通過轉錄途徑直接上調bcl-2表達［11］，這與我們的研究結果一致，隨著Akt及NF-κB表達水平的上調，bcl-2mRNA水平表達上調，三者間存在顯著正相關。且bcl-2mRNA水平與NIH分級、黏膜受侵有關，而與年齡、性別、組織學類型、轉移復發及周圍組織浸潤無關。本組結果提示，活化的Akt可通過其正性調節來進一步激活NF-κB，活化的NF-κB進而進入細胞核內調節細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。而PTEN與3者的表達呈負相關，表明PI3K/Akt與PTEN在GIST的發生發展中可能互相起拮抗作用。

GIST預后受多種因素影響，PI3K/AKt信號通路持續活化與GIST發生發展密切相關，PTEN的缺失也與GIST發生發展有重要關系。Akt、PTEN，NF-κB和bcl-2共同作用于GIST中，在它們的作用下使GIST細胞增殖和凋亡之間的動態平衡失調，導致腫瘤的進一步發生發展。

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