淺析巴斯德畢赤酵母表達系統的研究

王 艷 （山東省棗莊市畜牧獸醫局 277800）

對于一個有商業潛質和廣闊市場前景的獸用蛋白質類藥物的研究，主要是要尋找一條穩定的工藝條件和獲得較高的工作效率，巴斯德畢赤酵母表達系統就具有這方面的優點，其優越性表現在：分泌性表達，不需要復性，有效率為100%，純化程序簡單，大大降低了生產成本，尤其適用于動物干擾素的表達。

1 巴斯德畢赤酵母(Pichia Pastoris)表達系統的特點

巴斯德畢赤酵母是近年來興起的一個真核高效表達系統，具有許多獨特的優點，已迅速發展成為分子生物學領域中被廣泛用于重組蛋白生產的主要表達系統之一[1]。Pichia Pastoris是一種噬甲基酵母，可以在以甲醇為唯一碳源和能源的培養基中快速生長。它含有兩個基因編碼醇氧化酶(alcohol oxidase,AOX)—AOX1和AOX2，兩者序列相似，有92%的同源性，其編碼蛋白有97%的同源性和幾乎相同的特異催化活性。但在細胞中乙醇氧化酶的主要活力由AOX1提供，AOX2提供乙醇氧化酶的活力很低。在以甲醇作唯一碳源的培養基上，含有AOX1的酵母菌株生長表現為正常野生型Mut+，如果AOX1基因遭到破壞或被替換，只有AOX2的酵母菌株利用甲醇的能力減弱，則表現為生長緩慢性MutS。

根據其生物學特性和遺傳學特征，P.pastoris作為外源蛋白表達系統非常成功，總結如下[2]：（1）酵母屬于單細胞微生物；保留了細菌的特點，其營養要求簡單，生長快；操作方便易于培養，低成本，高密度，發酵技術也已非常成熟。（2）酵母是低等真核生物，不產生有毒物質，毒性比細菌小。（3）酵母具有真核生物的亞細胞結構，可進行很多典型的高等真核生物的蛋白翻譯后加工修飾；如糖基化、脂酸化、磷酸化以及蛋白裂解、折疊、二硫鍵的形成等。（4）Pichia Pastoris的分子生物學操作技術與釀酒酵母(S.cerevisiae )非常相似，而后者的遺傳背景和生理特性研究得比較透徹，是應用很廣泛的表達系統之一。（5）在醇氧化酶1(AOX1)基因來源的強啟動子的嚴格調控誘導下，無論胞內還是分泌，均可實現外源基因的高表達，而且產物易于純化，特別是高分泌性的外源蛋白占所有被分泌蛋白的30%以上，容易分離，適于商業生產[3]。

2 巴斯德畢赤酵母的表達載體

由于巴斯德畢赤酵母沒有穩定的附加載體(stable episomal vecters)，所以一般用整合型載體也稱穿梭載體作為外源基因的表達載體。即幾乎所有的畢赤酵母表達載體都設計為穿梭載體，即在酵母和大腸桿菌中都能復制的載體，包含大腸桿菌的質粒復制源和氨芐青霉素抗性基因。它可以在大腸桿菌中保存、擴增、和構建，線性化后轉入酵母細胞，使用方便。它有胞內表達載體如pPIC3、pPSC3k等和分泌性表達載體如pPIC9、pPIC9K等兩種類型，都有一些共同的結構，例如：AOX1基因的5′AOX1啟動子，編碼N端分泌信號(SIG)，多克隆位點(MCS)，轉錄終止和PolyA形成基因(TT)，3′AOX1序列，3′AOX1終止序列，篩選標記等等[4-6]。

3 巴斯德畢赤酵母的表達蛋白質的糖基化

該表達系統不存在原核表達系統的內毒素難以去除的問題，也不存在哺乳動物細胞表達系統的病毒和支原體的污染等問題，畢赤酵母能對表達的蛋白質進行N-和O-糖基化[7]，其中N-糖基化對于許多蛋白質的正確折疊、藥物動力學穩定性和功能是必需的，人們對其研究也相對深入。但是并不是說所有的潛在的糖基化位點均會發生糖基化。當蛋白質含有一致性序列Asn-Xaa-Thr/Ser(Xaa代表任何氨基酸)時，畢赤酵母能對其中的天冬氨酸殘基上的酰胺氮進行糖基化，產生N-糖基化。畢赤酵母能對蛋白質中蘇氨酸和/或絲氨酸上的羥基進行糖基化，產生O-糖基化。糖基化對重組蛋白質的產量和功能的影響因蛋白質而異，原因尚不明確。

4 提高外源蛋白在巴斯德畢赤酵母表達系統中的表達量的策略

要想實現外源蛋白在該系統的高效生產，就必須在實驗設計和具體操作中從下列環節予以重視，盡可能達到最優化。（l）應對所要表達的外源蛋白及其基因的結構、功能和特性有較全面、細致的了解；（2）注意信號肽的選擇，可以采用目的基因的信號肽，也可選擇載體自身的信號肽，但二者對蛋白的分泌效果不盡相同；（3）選擇合適的載體及合理的載體構成方式；（4）選擇恰當的受體菌，如帶有抗性標記、多拷貝篩選標記、蛋白水解酶缺失株等，既利于操作，有利于高效生產；（5）改進轉化方法與篩選鑒定方法，由于表達單位的不同整合方式、拷貝數、陽性轉化子，表達量的特異、快捷鑒定方法對獲得高表達株有重要意義[8]，因此應采用即操作簡便又可提高轉化率和表達單位拷貝數的方法，通常利用原生質法、電轉化法等，可根據實驗條件具體選擇；（6）采用較好的培養基和適宜的生長條件；（7）注意摸索誘導發酵參數，采用現代的發酵工藝，如目前的批量表達與連續灌注發酵罐。總之，雖然 P.pastoris表達系統是一個較好的被廣泛應用的真核表達系統，但是由于天然蛋白質的復雜性和多樣性，以及外源基因與酵母基因組重組情況的某些不可預知性，使得特定的外源基因的高效分泌表達并不可能一蹴而就，尚有許多的條件需要具體的摸索、嘗試和優化。

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[3]張平武,李育陽.新型酵母表達系統的研究[J].生物技術通訊,1999,10:306-309.

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