插入序列在水稻白葉枯病菌防治上的研究進展

佘宇佳，高必達

（湖南農業大學生物安全科技學院，湖南 長沙 410128）

1 水稻白葉枯病的危害

水稻白葉枯?。╔anthomonas，oryzae pv.oryzae，簡稱Xoo）最早發現于1884年日本福崗地區，現已是一種世界性的重要細菌病害[1-2]。從20世紀中葉以來，發病范圍逐步擴大，在亞洲、非洲、歐洲、美洲均有發生，且以亞洲發生最為嚴重。而我國主要發生在華東、華中、華南稻區，在其他部分稻區也有零星分布[3]。水稻白葉枯病菌是由革蘭氏陰性菌黃單孢水稻變種引起的一種維管束病害[4]。病原菌經傷口或水孔等進入寄主維管束，在木質部中大量繁殖，然后通過維管束蔓延至整個植株，最后導致病害不斷擴大加重[5]。白葉枯病在潮濕和低洼地區發病比較頻繁，一般秈稻重于粳稻，雙季晚稻重于雙季早稻，單季中稻重于單季晚稻，矮稈闊葉品種重于高稈窄葉品種，不耐肥品種重于耐肥品種。水稻在幼穗分化期和孕期易感病。受災后的水稻葉片枯萎，光合作用受到妨礙，稻穗的充實率降低，致使不實粒增加，同時造成米質疏松脆裂，食味降低。一般減產20%～30%，嚴重時能夠達到50%，甚至不能抽穗導致絕收[5]。

2 插入序列

1989年世界上首次報道插入序列（Insertion sequence，簡稱IS），至今在原核生物和真核生物中發現了超過500種不同的IS。最簡單的轉座子不含有任何宿主基因、在基因組中存在一個或多個插入位點的小分子DNA片段常被稱為插入序列，廣泛存在于原核和真核生物界中，同時細菌染色體和質粒的重要組成部分[6]。IS在細菌基因組能編碼、自主進行轉座、插入位點隨機、插入后使宿主染色體的插入位置上產生短的正向重復序列等。這些都能造成宿主基因缺失或誘發突變，以致同源宿主差異的產生。所以IS對那些具有使植物染病能力的細菌在不同環境的生存起著重要作用，且常被作為一種標記物用來鑒定細菌的種群結構特征[7]。

IS的兩大特征是：（1）插入序列在插入靶位點，造成左右兩端的重復；（2）插入序列在插入靶位點上自身終端序列都會生成較短的反向重復序列（Inverted repeat，IR）。大多數 IR 為 10～40 bp 左右，分為兩個功能區域，一個是發生轉移反應的斷開之處，長度只有2～3 bp，另一個對特異性序列進行識別，與T轉座酶相連接。IS的轉座的概率是極小的、插入位點隨機，與自發突變率同一個數量級，其精確切離可誘發的突變回復為野生型，不精確切離可能會導致兩端相連的基因沉默或缺失。

3 IS在防治水稻白葉枯病中的重要性

水稻白葉枯病是危害我國水稻生產的主要病害之一，傳統的化學防治難以對水稻白葉枯菌奏效，種植抗病品種是現在國內外普遍使用的防治方法。水稻抗病性的遺傳研究始于日本，至今已有近30種水稻白葉枯抗性基因從不同的水稻品種和野生稻中鑒定出來，其中許多被用于水稻育種和疾病控制[8]。我國主要栽培品種所帶有的抗白葉枯病基因源主要為Xa3（粳稻）和Xa4（秈稻）。但長時間、大規模種植單一抗源的品種必將引起病原菌群體遺傳結構的變化，產生新小種，導致品種抗性的喪失。如印度尼西亞，印度，菲律賓和我國稻區大量種植帶有單一Xa4抗源的品種，已造成白葉枯病源菌小種的發生改變，導致這個抗性基因在我國部分稻區已基本喪失抗性。

從進化上看，基因的內部IS水平轉移和重復序列的增加或缺失是植物病原細菌致病性變異的主要途徑。利用位點克隆和轉座子標定技術已分離出多種新的植物抗病基因，其中包括水稻抗白葉枯病的Xa21和Xa1基因。弄清基因、IS與毒力的相互關系是快速鑒定、區分Xoo致病型的前提，同時也是當前防治水稻白葉枯病的重要策略。Ardales等[9]在對日本白葉枯病菌株MAFF311018進行研究時，發現基因組中包含大量的插入序列和無毒基因，病菌的致病型和通過由插入序列獲得的病菌進化分類存在著對應關系。Ochiai、Ardales等分別以IS1112、IS1113為探針對斯里蘭卡和菲律賓水稻白葉枯病菌的研究，證實了插入序列與病菌的致病型之間存在一定的相關性。由此可見插入序列在基因組進化中具有重要作用，與水稻白葉枯病菌的致病型的分化，毒力強弱等有相關聯系，這對研究插入序列提供了良好的基礎。因此，全面分析IS、比較各菌株之間IS的分布差異及其整合特性對研究不同國度及區域的白葉枯病菌的毒力分化，以及抗病品種的合理布局、輪換和相互間的交流，都具有十分重要的意義。

4 水稻白葉枯病菌各致病型的鑒定方法

水稻白葉枯病是一種利用寄主的抗性能夠有效控制危害的細菌病害，與其寄主水稻是協同進化的關系。方中達[10]從全國各病區采集了835個菌株，將其分為了7個致病型。而王春蓮等[11]發現我國同一區域白葉枯病原菌發生了變化，并推測病原菌的變化可能是大面積種植的水稻感染了其他類型的致病型，研究表明水稻白葉枯病原菌的群落結構隨著抗性品種的種植而發生了改變。

對于水稻白葉枯病原菌致病型的鑒定可以通過生理特征、生化性質、毒性以及分子水平等不同角度來衡量，但各有不足。如生理生化手段是建立在菌株外在生物學特性的基礎上的，在不同的條件下，不同的實驗操作、分析下會導致不同的實驗結果，因為在Xoo中與致病力相關的某些蛋白是可誘導表達的，Tsuge等[12]發現Xoo中的一些蛋白在特定的培養基上才能表達。

從分子角度來看，對Xoo全基因組測序無疑是最精準的方法?；蚪M是用于描述生物的全部基因和染色體組成，將Xoo的全基因組測序可以破譯其全部遺傳信息，這對研究Xoo自身遺傳信息和結構、Xoo與相關寄主因子及其致病性，培育抗病新品種水稻有著極其重要的意義。基因的結構和功能分析，將使人們深入認識及Xoo的侵染及水稻抗病的機理，大規模的試驗技術也將會使人們有更多機會篩選到更好的抗性基因，這也是控制水稻白葉枯病害的更加安全和經濟有效的方法。目前已徹底完成全基因序列測定并公布的有3個水稻白葉枯病小種：日本菌株MAFF311018，韓國菌株KACC 10331和菲律賓菌株PXO99A。比較分析3種水稻白葉枯病基因組，發現MAFF和KACC的基因組總的來說在基因含量和組織結構上都高度地相似，而PXO99A與MAFF、KACC差異甚大。Ochiai等在測定MAFF全序列時也將IS做了分類統計：共有25種類型多達611個插入序列，其中386個為完整IS，225個為不完整IS，這些序列總和占到菌株全基因序列的10%（MAFF全序列為4 940 217 bp）。Xoo屬于高適應性種類，在不同的環境下能分化出不同的致病型，所以想要測定所有致病型的全基因組序列幾乎是不可能的。對基因組上特定位點序列的比較是一個相對容易且成本低廉的方法，通過對存在差異性的位點研究分析，可以探明它們的系統進化關系。

白葉枯病原菌的分類長期采用的是植物病理學的方法，將寄主上抗性反應型來劃分致病型。但隨著分子生物學的興起，近20年，國內外研究白葉枯病原菌多樣性的手段逐步變為以RFLP與PCR為主。對IS的拷貝數及插入位點的研究大多采用的是RFLP、Southern雜交rep-PCR、和IS-PCR技術。Rep-PCR和IS-PCR均利用IS多拷貝序列上的部分序列作引物來擴增IS及其旁側序列，通過分析不同種群中的差異來研究種群之間的遺傳多樣性。這些PCR方法雖然能形成直觀的指紋圖譜但靈敏度不高，而PCR技術檢測周期長、假陽性現象時有發生，這些對IS研究有一定的局限性。RFLP與Southern印跡雜交的方法是測定基因拷貝數、遺傳圖譜構建、分析細菌群落結構和多樣性的標準方法。其特點是：數據多態信息量大，呈共顯性標記，不受顯隱性關系、環境條件、發展階段及組織部位影響，結果穩定，重復性好，探針多。但這些都十分費時費力。特別遇到一個插入位點有多拷貝的TDNA片段插入時，用Southern雜交在酶切時會產生相似的DNA片段，電泳分析時很難分辨清楚。而絕大數的IS拷貝數眾多且插入位點復雜，用RFLP、Southern雜交進行測定拷貝數難以得到真實準確的結果。易用性日益成為主要的核酸定量檢測技術，隨著科技的發展，功能更強大、更特異、更靈敏的熒光標記染料不斷出現，實時熒光定量PCR技術將在水稻白葉枯菌的遺傳多樣性研究中得到廣泛的運用。

5 展望

水稻與白葉枯病原菌互作符合基因對基因的關系[13]，這使得對水稻白葉枯病的研究已成為研究寄主和病原物互作的模式，當今對于水稻白葉枯菌的研究主要集中在白葉枯菌致病性基因和遺傳多樣性上。IS是一個能自行轉座的小DNA片段，它的移動能造成鄰近基因的改變，從而使生物體生物學性狀產生變化。所以對水稻白葉枯菌的IS的研究有利于更好的區分水稻白葉枯菌各個不同的致病型及掌握它們的特征。其中水稻白葉枯菌中IS的拷貝數、靶標位點及其旁側序列是區分不同致病型的重要方面。實時熒光定量PCR技術由于其靈敏性及

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