農桿菌介導水稻轉基因技術的原理與應用研究進展

張紅霞，鄧啟云，吳 俊

（1.中南大學隆平學院 湖南 長沙 410125;2.湖南雜交水稻研究中心 湖南 長沙 410125）

轉基因技術就是利用DNA重組技術，將克隆到的外源優良DNA導入到植物體細胞基因組中，改變作物的遺傳性狀，使其朝著人們理想的方向發展。從1983年第一例轉基因植物——煙草問世以來，轉基因技術發展迅猛，至2005年轉基因植物已經在21個國家進行種植。2009年，全球種植轉基因作物達1.34億hm2。轉基因技術方法主要有基因槍法、電激法、PEG法、花粉管介導法和農桿菌介導法。農桿菌介導轉化法具有轉化的外源基因結構完整、整合位點較穩定、轉基因低拷貝、基因沉默幾率低、遺傳穩定以及能夠轉化大片段的DNA（可達50 kb）等突出優點[1－2]，成為目前應用最多的轉基因技術。近年來，國內外廣泛開展了水稻轉基因研究工作，已經有多個有益農藝性狀基因導入到水稻材料中，并且獲得了大量的轉化植株。本文就水稻農桿菌介導轉化的原理、研究進展及轉化基本因素進行綜述。

1 水稻農桿菌轉基因原理

農桿菌轉化系統是一種天然的基因轉化系統。農桿菌分為根瘤農桿菌和發根農桿菌。根瘤農桿菌中含有腫瘤誘導（Ti）質粒，Ti質粒上含有可轉移DNA(T-DNA)區、毒性區（Vir區）以及冠癭堿代謝基因編碼區。T-DNA兩端是兩個25 bp的重復序列，分別稱為左邊界和右邊界，兩個邊界序列之間是生長素和細胞分裂素合成基因以及冠癭堿合成基因。Vir區中也含有多個基因段，如VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH等，每個基因段都含有多個基因。當植物受到傷害時，分泌含有酚類化合物的汁液，這些酚類化合物一方面通過染色體毒性基因（chvA、chvB）等介導的趨化性促使農桿菌向植物受傷部位移動并附著于植物細胞表面；另一方面則被Ti質粒上由VirA和VirG組成的雙組分調節系統識別，從而誘導其他Vir的表達。VirD1和VirD2共同作用，由T-DNA右邊界開始向左邊界切割產生一條T-DNA單鏈，并與Vir其它表達蛋白結合成復合體轉移到農桿菌外，然后進入細胞到達細胞核內并整合到細胞染色體上。

T-DNA的轉移只與兩個邊界序列有關，尤其右邊界對T-DNA的準確轉移是不可缺少的，而邊界序列之間含有什么基因并不影響T-DNA的轉移。因此，可以用外源基因代替T-DNA區內的基因，進而利用農桿菌將這個改造后的T-DNA轉移到植物基因組中，這樣就可以獲得所希望得到的轉基因植株。隨著對農桿菌轉化系統的了解不斷深入，人們對Ti質粒進行了多種方式的改造，使載體系統不斷更新，轉化效率逐漸成熟，應用范圍越來越廣泛。

2 農桿菌介導水稻轉基因技術的發展概況

農桿菌介導的水稻遺傳轉化研究最早始于1986年，Babat[3]等通過PEG法將農桿菌原生質球與水稻原生質體融合，獲得了部分能夠合成胭脂堿的水稻愈傷組織。1992年Chan[4]以成熟胚、離體根為起始材料進行研究，但未能獲得轉基因再生植株。l993～1994年，農桿菌介導的水稻遺傳轉化研究取得了重大突破，Chan等[5]首次通過農桿菌介導獲得了轉基因植株，隨后，Hiei等[6]實現了對粳稻的高頻轉化，轉化率達到28.6%，表明粳稻的農桿菌介導轉化體系已基本建立起來，該研究同時也證明水稻盾片是良好的外植體來源，且農桿菌攜帶的雙元載體能夠明顯提高粳稻比如越光稻的轉化頻率。此后的十幾年，農桿菌介導水稻遺傳轉化研究得到了迅速發展。Rashid等[7]將農桿菌介導轉化法應用于優質秈稻Basmati370水稻取得成功，且發現乙酰酊香酮在共培養階段是必不可少的。Dong等[8]報道農桿菌轉化在爪哇稻Gulfmont和Jefferson上取得成功；Hoque等[9]于2005年建立了適合于孟加拉秈稻種質的農桿菌介導轉化體系，并證明水稻幼胚作為外植體較成熟胚有更高的轉化率，共培養時間為3 d最優；Hiei和Komari[10]2006年建立了一套適合秈稻I群體的高效轉化體系，證實轉化效率與凝膠劑的種類和共培養基成分密切相關。林擁軍等[11]建立了農桿菌介導的粳稻品種牡丹江8號的高效轉基因體系。王逸群等[12]采用農桿菌介導法將高賴氨酸蛋白基因導入到谷稈兩用水稻中，GUS組織化學染色、PCR擴增、Southern雜交等分析都表明，該基因已經整合到水稻基因組中；他們對9株轉基因水稻葉片賴氨酸含量進行測量，發現大部分植株的賴氨酸含量都有明顯的提高，最高幅度達到了22.71%。胡昌泉和蘇軍等[13]采用農桿菌介導法將胚乳特異性表達谷蛋白1（Glutelin1，Gtl）基因控制下的可溶性淀粉合成酶基因sss導入秈稻恢復系明恢86，共獲得53個獨立轉化再生植株。PCR檢測表明，sss基因已整合進水稻的基因組中。直鏈淀粉含量測定結果表明，轉基因植株后代直鏈淀粉含量較對照有較大幅度的下降；胡利華，吳慧敏等[14]利用根癌農桿菌介導法將檸檬酸合成酶（citrate synthase）基因CS導入雜交秈稻優良恢復系明恢86，共獲得48株T0再生植株，通過分子檢測，證明有陽性植株產生。Ignacimuthu等[15]將來源于菜豆種子的α淀粉酶阻抑基因通過農桿菌介導法轉入到Basmati水稻（PB1）中，174個潮霉素抗性植株產生并呈GUS陽性反應。PCR和Southern雜交證實4.9 kb長的α淀粉酶阻抑基因已經存在，并通過Western印記雜交證實相關蛋白的表達。總的來說，農桿菌介導水稻遺傳轉化在近十年里取得了顯著進展，不僅為水稻品種的遺傳改良奠定了基礎，而且為水稻的分子生物學提供強有力的實驗證據。

3 農桿菌介導水稻遺傳轉化的基本因素

3.1 水稻親本和受體

Chan等[5]研究發現粳稻轉化頻率較秈稻轉化頻率高，這可能與秈稻愈傷組織形成、繼代和再生植株困難等因素有關。在水稻的遺傳轉化中，通常轉化受體來源于幼胚、幼穗和成熟胚的生長旺盛的胚性愈傷組織[16]，但是不同來源的愈傷組織的轉化頻率是不一樣的。Vijayachandra[17]研究水稻不同組織（細胞）對農桿菌vir基因的誘導，結果表明，盾片和盾片來源的愈傷組織是最容易被農桿菌轉化的組織。黃健秋等[18]采用未成熟胚來源的愈傷組織進行根癌農桿菌轉化時，其轉化頻率均高于成熟胚來源的愈傷組織的轉化頻率，平均高出1～2倍。因此，幼胚與成熟胚作為外植體各有優勢，顯然選擇幼胚作為愈傷組織來源更適合為轉化的受體，轉化效率較高，但是幼胚受到季節的限制且易被污染，成熟胚來源的愈傷組織雖然轉化頻率低，但是污染程度相對較低，且成熟胚可長期保存。鄭杰[19]就是以水稻基因組測序品種日本晴成熟胚為研究材料,對根癌農桿菌介導的水稻轉化系統進行了優化，最終GUS表達率達到30%。此外，轉基因技術是一項針對性很強的單一性狀遺傳改良技術，受體親本應選擇綜合農藝性狀更好的品種。近年來，超級稻的轉基因研究已受到關注，并可能成為水稻轉基因的重要研究方向之一。

3.2 農桿菌菌株和質粒要求

3.2.1 農桿菌菌株 選取合適的農桿菌菌株和優良的質粒對轉化來說非常重要。用于水稻轉化的農桿菌菌株較為普遍的有 A281、A656、LBA4404、EHA101、EHA105、AGL1。李雙成[20]等以 3 個秈稻品種和2個粳稻品種為對象，對農桿菌轉化水稻過程中影響轉化效率的因素進行了研究，其研究發現菌株AGL1和EHA105按一定比例混合共轉化對抗性愈傷率有顯著影響。現在應用最多的是EHA105菌株。

3.2.2 質 粒 對質粒的要求有選擇標記，啟動子，外源基因等。常用的選擇標記有三類:潮霉素磷酸轉移酶基因（hpt基因）、新霉素磷酸轉移酶基因（npt基因）和除草劑抗性基因（bar基因）。而啟動子的種類與靶細胞中基因的表達水平密切相關，水稻基因轉化中所使用的啟動子主要有CaMV35S啟動子、Nos啟動子、Actl啟動子、Ubiquitin啟動子等。以常用的表達載體pCAMBIA1301為例，該質粒總長為13.1 kb，其T-DNA左右邊界內的區段含有hpt基因，gus基因和多克隆位點，其中的啟動子為35S啟動子。

3.3 轉化不同階段培養基與技術操作

3.3.1 誘導階段 對水稻的愈傷誘導其基本培養基有 NB，CC，N6，MS。殷麗青等[21]研究發現 NB 培養基是粳稻品種廣泛運用的誘導培養基，且NB培養基在秈稻愈傷誘導中也比其他培養基好一些。

3.3.2 共培養階段 這一階段的培養基非常關鍵，其中乙酰酊香酮則是必不可少的成分。另外，愈傷組織細胞處在DNA復制階段以及浸泡愈傷組織時農桿菌有合適的濃度對轉化效率都有著重要的影響。一般共培養時間是2～3 d。部分研究發現，若在共培養基上墊一層濾紙，然后將愈傷接種到濾紙上，可以減少農桿菌的污染。

3.3.3 篩選與分化 篩選和分化階段的培養基，主要注重抗生素的濃度以及激素的配比。過高的抗生素濃度會殺死陽性愈傷，反之則不能起到很好的篩選作用。共培養后愈傷接種到篩選培養基的操作也顯得非常關鍵。如進行漂洗，干燥處理等。周玲艷[22]發現愈傷組織經干燥處理不僅可以有效殺死農桿菌，而且可以改善愈傷組織狀態，提高轉化率。李雙成[20]認為瓊脂粉加倍和超凈工作臺上風干4 h的方法是最適合的干燥培養方式。切取篩選后的愈傷組織要經過預分化處理，其目的就是使愈傷組織胚性增強，分裂與再生能力提高，這樣有利于外源基因整合[20]。然后將愈傷組織轉入到分化培養基，進行光照和暗室的循環處理，使其大量分化。

3.3.4 壯苗生根 分化3周后，轉入到生根培養基中進行壯苗生根培養，這一階段要保證其有處在正常的生理環境中，如光照，濕度以及黑暗處理。再生植株成長到一定階段，就可以檢測其基因導入情況。

4 展望

水稻是世界上最大的糧食作物，全球超過三分之一的人口都以稻米為主食。長期以來，水稻雜交育種研究取得了令人矚目的成績，水稻產量大幅度提升。育種家們采用人工常規雜交技術選育了成千上萬的品種并應用于生產，為保障糧食安全與經濟社會穩定做出了巨大的貢獻。傳統技術一般可在生物種內個體上實現基因轉移，但操作的精確性較差，選育時間較長。而轉基因技術轉移基因可不受親緣關系的限制，且基因操作選擇的準確性較高，此外基因的精確導入還能大大縮短育種年限。因此，轉基因技術與常規育種技術的緊密結合可以大大提高育種效率。隨著越來越多的有益基因被克隆和鑒定，農桿菌介導法必將在今后的分子育種中發揮越來越大的作用。

[1]王關林，方宏筠.植物基因工程原理與技術[M].北京：科學出版社，1998.

[2]Ramesh S,Nagalhara D,Reddy V D,et al.Production of transgenic indica rice resistant to yellow stem borer and sap-sucking insects,using super-binary vectors of Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Science,2004,166:1077-1085.

[3]Baba A,Hasezawa S,SyonoK.Cultivation of rice protoplasts and their transformation mediated by Agrobacterium spheroplasts[J].Plant Cell Physiol,1986,27:463-468.

[4]Chan M T,Lee T M,Chang H H.Transformation of indica rice(oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Cell Physiol,1992,33:577-583.

[5]Chan M T,Chang H H,Ho SL,et a1.Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric αamylase promoter／β-glucuronidase gene[J].Plant Molecular Biology,1993,22（3）：491-506.

[6]Hiei Y,Ohta S,Komari T,et a1.Efficient transformation of rice mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].Plant J，1994，6（2）：271-282.

[7]Rashid H,Yokoi S,Toriyama K,et a1.Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice[J].Plant Cell Reports,1996,15（10）：727-730.

[8]Dong J,Teng W,Buchholz W G,et a1.Agrobacterium-mediated transformation of javanica rice[J].Molecular Breeding,1996，2（3）：267-276.

[9]Hoque M,Mansfield J,Bennett M.Agrobacterium-mediated transformation of indica genotypes:all assessment of factors affecting the transformation efficiency[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2005，82：45-55.

[10]Hiei Y,Komari T.Improved protocols for transformation of indica rice mediated by Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2006,85：27l-283.

[11]林擁軍，陳 浩，曹應龍，等.農桿菌介導的牡丹江8號高效轉基因體系的建立[J].作物學報，2002，28（3）：294-300.

[12]王逸群，鄭金貴，謝寶貴.農桿菌介導將高賴氨酸蛋白基因導入谷稈兩用水稻[J].應用與環境生物學報，2005，11（3）：276-278.

[13]胡昌泉，蘇 軍，陳在杰，等.農桿菌介導法獲得轉可溶性淀粉合成酶基因秈稻[J].福建農業學報 ，2003，18（2）：65-68.

[14]胡利華，吳慧敏，周澤民，等.利用農桿菌介導法將檸檬酸合成酶基因（CS）導入秈稻品種明恢86[J].分子植物育種，2006，4（2）：160-166.

[15]Ignacimuthu S,Arockiasamy,S.Agrobacterium-mediated transformation of an elite indica rice for insect resistance[J].Current Science,2006,90（60）：829-835.

[16]施利利，王松文，蔡寶立，等.影響農桿菌介導的水稻遺傳轉化效率的因素[J].天津農學院學報，2003，10（4）：53-57.

[17]Vijayachandra K,Palanichelvam,Veluthambi K.Rice scutellum induces Agrobacterium tumefaciens vir genes and T-strand generation[J].plant mol biol,1995,29:125-133.

[18]黃健秋，衛志明，安海龍，等.根癌土壤桿菌介導的水稻高效轉化和轉基因植株的高頻再生 [J].植物學報，2000，42（11）：1172-1178.

[19]鄭 杰.農桿菌介導的高效水稻遺傳轉化體系的研究[J].湖南農業科學，2008，（2）：6-7，10.

[20]李雙成，王世全，尹福強，等.提高農桿菌介導轉化水稻效率的因素[J].中國水稻科學，2005，19（3）：231-237.

[21]殷麗青，張建軍，王慧梅，等.提高根癌農桿菌介導水稻轉化頻率的研究[J].上海交通大學學報（農業科學版），2003，21：43-47.

[22]周玲艷，姜大剛，吳 豪，等.農桿菌介導水稻轉化條件的優化[J].華南農業大學學報，2003，24（3）：43-45.