豬分子育種研究進展

劉 榜

（華中農業大學動物科技學院動物分子生物學與育種實驗室，農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

分子育種主要是一種利用DNA 水平上的分子標記對生物群體進行遺傳改良。動物分子育種方法主要包括標記輔助育種、轉基因育種和體細胞克隆育種。本文主要從標記輔助育種和轉基因育種兩個方面綜述豬分子育種的研究進展。

1 標記輔助育種

標記輔助育種是利用DNA 水平上的分子標記進行豬的遺傳改良，現階段DNA 標記輔助育種技術僅僅是一種輔助手段，還必須與常規育種技術特別是數量遺傳學方法相結合，故稱之為標記“輔助”育種。標記輔助育種中DNA標記的鑒定是基礎，目前雖然有大量的豬經濟性狀候選基因多態性以及關聯分析結果，但真正已經鑒定的QTN 卻甚少。QTN 鑒定需要利用大規模的資源群體和基因組信息，現對豬基因組研究進展、可以利用的QTN 及標記輔助選擇方法進行介紹。

1.1 豬基因組計劃研究進展

豬基因組研究已經從單個基因的克隆和功能研究發展到對整個基因組的研究。中國科學院北京基因組研究所(Beijing Genomic Institute)與丹麥動物科學研究所(Danish Institute of Animal Science)、皇家獸醫與農業大學(the Roya l Veterinary and Agriculture University(KVL))、丹麥養豬業的代表共同于2000 年10 月20 日簽署豬基因組測序計劃協議。至2005 年，該計劃完成了380 萬個鳥槍法測序反應結果，覆蓋了0.66 個基因組（Wernersson,R 等，2005），并建立了97 個非標準化的cDNA 文庫，提供了大約100 萬條EST 序列（Gorodkin,J.等，2007）。在繼2004 年先后完成了雞和牛的基因組測序后，美國農業部(USDA)展開了豬基因組研究計劃，2006 年獲得了USDA 首批1000 萬美元的基金支持，正式在Sanger 基因組測序中心開始以杜洛克豬為材料的基因組測序工作。到2009 年10 月2 號，已完成了豬98%的基因組草圖，所有序列都已經釋放，可以通過Preensemble(http://www.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index)獲得。

1.2 已經應用于標記輔助育種的QTN

QTN 是指通過改變某個特定核苷酸，能夠使個體的表型從一種轉變到另外一種（Glazier,2002）。可以說QTN 是性狀產生變異的基礎，是QTL 對表型影響的根本原因。目前，在豬中已經鑒定出3 個與肌肉發育和日增重相關的QTN 和1個可能的影響肌肉生長的QTN，他們分別是蘭尼定1 型受體基因（ryanodine receptor 1,RYR1）、胰島素樣生長因子2型基因（insulin-like growth factor 2,IGF2）、黑皮質素受體4（melanocortin receptor 4,MC4R）基因和肌肉生長抑制素（myostatin,MSTN）基因。

RYR1 參與了豬肌肉生長發育過程，與骨骼肌肌質網中主要鈣離子釋放通道。在該基因1843bp 位置發生的一個CT突變，導致編碼蛋白在這個位置從精氨酸到半胱氨酸的改變（Fujii J 等，1991）。在不同的豬品種中，這個堿基的改變與瘦肉率和體重呈顯著相關。2003 年，與豬肌肉發育相關的第二個QTN 在印記表達的IGF2 基因中發現（Van Laere A等，2003），在IGF2 的第三內含子中的一個進化保守的CpG島區域，3072 位置的GA 突變導致了該基因表達量升高三倍，并增加了豬的肌肉生長速度和心臟體積與減少了脂肪的沉積。MC4R 是一個G 蛋白偶聯受體，參與了一個與采食量和能量平衡的重要通路。Kim KS,等（2000）在MC4R中發現893 位GA 錯義突變導致了其編碼的天冬氨酸改變成天冬酰胺，這個變異被證實是影響背膘厚、日增重的QTN。第4 個可能的QTN 是MSTN 啟動子中的447 位AG 突變，Stinckens A 等（2008）發現該突變導致了肌細胞增強子3（MEF3）的結合位點的丟失，并發現發生突變的四周齡仔豬比野生型的MSTN 基因的表達水平低，推測該位點可能是影響肌肉生長的QTN。上述4 個QTN 對豬日增重與肌肉生長性狀有較大影響，均可作為標記在選種中應用。但在應用的過程中應考慮他們之間的相互作用，有關4 個基因間的互作Stinckens,A 等（2009）在長白豬和大白豬中發現了他們之間的關系。

1.3 標記輔助選擇方法

標記輔助選擇（Marker Assisted Selection,MAS）是通過尋找對動物特定性狀有較大影響的數量性狀位點（Quantitative Trait Loci,QTL）附近的分子標記，并 通過判斷標記的基因型對種畜進行選擇的方法。利用MAS可以做出早期選種，縮短世代間隔，提高選擇的準確性、提高選擇強度，降低育種成本，加快遺傳進展，特別對于遺傳力低的性狀、晚期表現性狀，以及活體難于度量的性狀更具有價值。目前，依據選擇標記與性狀控制位點的關系，MAS 可分為標記距離較遠的連鎖平衡（Linkage Equilibrium,LE）MAS（LE-MAS），標記距離較近的連鎖不平衡（Linkage Disequilibrium,LD）MAS（LD-MAS），以及標記本身即為causal 位點的基因輔助選擇（Gene Assisted Selection,GAS）。這三種方法都已經在動物育種上進行了應用。此外，最近還出現了一種全基因組選擇的方法，預計將是未來標記輔助選擇發展的重要方向之一，但目前因為檢測成本過高暫時還不能大面積推廣使用，同時全基因組選擇亦還有部分理論和方法問題尚未完全解決。

1.3.1 連鎖平衡MAS

連鎖平衡MAS 使用的是連鎖平衡標記（LE 標記），LE標記都是在一些對性狀有較大影響的QTL 區域附近，是一類與QTL 連鎖的標記。由于LE 標記相對LD 標記和直接標記，它與形成QTL 中的致因突變位點相隔還較遠，只是與QTL 有一定程度的連鎖，選擇效果不能保證，特別是不能保證所有家系中都存在這種連鎖關系。所以，在實施選種中，不能跨越家系去使用LE 標記，這限制了連鎖平衡MAS 的使用范圍。

1.3.2 連鎖不平衡MAS

連鎖不平衡MAS 使用的是連鎖不平衡標記（LD 標記），這類標記主要是通過精細定位或者候選基因的方法得到的（Rothschild and Soller,1997）。由于LD 標記與對性狀影響的功能突變位點緊密連鎖，所以選擇的有效性大大地提高，而且通常能在不同的家系中應用連鎖不平衡MAS 進行選種。對現階段而言，LD 標記應是分子育種使用的主要標記類型。

1.3.3 基因輔助選擇

基因輔助選擇使用的是直接標記，這種標記直接來自對性狀有較大影響的QTN。由于這種標記直接來源于影響性狀的基因的功能突變位點，所以能夠用于不同情形，包括不同家系的輔助選擇。但是，目前已經在豬中鑒定的QTN 數量甚少，實際能用于基因輔助選擇的標記并不多。

1.3.4 全基因組選擇

由于多個物種的測序完成和SNP 芯片的出現，一種新的選擇方法——全基因組選擇在2001 年被提出（Meuwissen，2001）。全基因組選擇是指使用覆蓋全基因組上的標記來進行選擇，與之前的MAS 相比，不依賴于對性狀影響較大的標記的數目，并能對多個性狀進行同時選擇，提高了選擇的準確性。通常，全基因組選擇的方法有兩步，首先是通過對資源群體進行全基因組的SNP 芯片掃描和各個性狀表性值的測定統計，估計出基因組不同組分對目標性狀的影響程度，并構建出育種值的預測模型；然后根據育種群體中多SNP、單倍型、單倍型域、染色體區段等綜合構成的全基因組基因型信息進行估計，得到個體的基因組估計育種值（Genome EBV,GEBV），然后依據GEBV 進行選種。由于全基因組選擇利用的信息量最大，選擇的準確性將極大地提升，這將是今后家畜分子育種的主要發展方向。

2 轉基因育種

轉基因育種是指通過轉基因的方法，將外源的基因（包括種內和種間）整合到豬的基因組中或者將豬自身的基因敲除或沉默，借此來定向改變豬的性狀，以轉基因材料進行的育種。轉基因技術作為育種技術的優點在于：不但可以打破物種界限導入其他物種的優良基因，也可以通過對物種內現有基因組的“精細手術”，獲得依靠自然選擇與人工選擇無法新基因組合。目前，轉基因技術主要用作生物工程手段，作為分子育種技術尚處于探索階段。但隨著國家轉基因重大專項的實施，轉基因技術將會成為家畜分子育種的重要內容。

轉基因技術已成功運用于豬，獲得了一些轉基因豬。1985 年，Hammer 等通過顯微注射的方法，將由小鼠MT-1啟動子驅動的人生長激素基因（hGH）注射到豬、羊和兔卵細胞的原核中，該融合基因成功地整合到了豬和兔的基因組上并能正常表達；1991 年，Shamay 利用同樣的方法，將小鼠乳清酸性蛋白基因（mWAP）轉入到豬，mWAP 基因在豬的乳腺中成功表達；1992 年，Swanson 等成功獲得了能生產人血紅蛋白的轉基因豬，Muller 等將小鼠的MX1 基因轉入豬體內，試圖生產抵抗流感病毒的轉基因豬；1995 年，Rosengard 等將人的補體抑制因子和衰退加速因子(hDAF)轉移至豬胚中，有27 頭轉基因豬的hDAF 在其內皮細胞、血管平滑肌和鱗狀上皮細胞等細胞中有不同程度的表達；2001 年，加拿大Guelph 大學Golovan 等人通過顯微注射原核胚的方法，培育出轉植酸酶的轉基因環保型豬，使得糞便中磷的排放量減少了75%；2003 年，Ramsoondar 等將α(1,3)半乳糖苷轉移酶基因敲除的豬，試圖解決器官移植時的免疫排斥反應；2004 年，日本克隆出體內含有水母基因的轉基因豬；2006 年，Lai 等獎秀麗線蟲的編碼ω-3 脂肪酸去飽和酶（FAT-1）基因克隆到豬中，顯著地提高了組織中不飽和脂肪酸的含量。

我國的轉基因豬也已取得了重要成果：1989 年，中國農業大學陳永福與湖北省農科院生物技術研究所合作，將豬生長激素基因（GH）轉入湖北白豬中，顯著提高了生長速度與飼料利用率；湖北省畜牧所與中國農科院蘭州獸醫所合作，將抗豬瘟病毒（HCV）基因導入豬中，獲得了抗豬瘟的轉基因豬（鄭新民、魏慶信等，1998）；2000 年，鄭新民、魏慶信等用顯微注射的方法，生產出來能夠合成人血清蛋白（HAS）的轉基因豬；2006 年底，東北農業大學劉忠華教授帶領的團隊研制出中國首只轉基因“熒光豬”；2008 年，中國農科院北京畜牧獸醫研究所李奎教授等人，繼美國之后培育出了轉FAT-1 基因的保健豬。這些轉基因材料一旦經過生物安全評價就可以作為育種素材進行新品種的培育。目前，我國轉基因生物新品種重大專項的啟動將進一步推動轉基因豬的研究進程。