耳后進路大鼠耳蝸中階側(cè)壁顯微注射攜帶EGFP慢病毒的實驗研究*

潘 松，付 勇，劉 杰，劉立思△

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，湖北 武漢 430030;2.咸寧學院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，湖北 咸寧 437100;3.浙江大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江 杭州 310003)

外周性感音神經(jīng)性聾是一種嚴重影響人類生活質(zhì)量的疾病，其病因主要是由于耳蝸毛細胞的損傷引起，而毛細胞在成年哺乳動物不可自行再生。針對毛細胞再生的治療方式包括基因治療和細胞替換治療。基因治療可用于保護毛細胞[1]或產(chǎn)生新的毛細胞[2]，細胞替換治療是利用干細胞產(chǎn)生新的毛細胞和聽神經(jīng)。不管是基因治療還是細胞替換治療，經(jīng)耳蝸行局部顯微注射，將基因和細胞導入耳蝸是最有效的方式。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)大鼠圓窗導入綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標記的神經(jīng)干細胞后，可以在前庭階和鼓階發(fā)現(xiàn)GFP的表達，但在血管紋和Corti器無明顯綠色熒光表達[3-4]。如何將外源性基因或細胞導入耳蝸Corti器部位，從而更好地發(fā)揮針對Corti器損傷的治療作用。本實驗以此為出發(fā)點，通過大鼠耳后切開手術進路，經(jīng)耳蝸中階側(cè)壁顯微注射攜帶增強型綠色熒光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的慢病毒，并觀察其在耳蝸的表達情況，為后續(xù)的經(jīng)耳蝸中階導入以慢病毒為載體的基因治療提供實驗基礎。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 攜帶EGFP的慢病毒購于上海比昂公司，病毒滴度為2×108TU/m L。人工內(nèi)淋巴液參照文獻[5]配置，NaCl 1 m M ，KCl 126 m M ，KHCO325 m M ，M gCl20.025 mM ，CaCl20.025 m M，K2HPO41.4 m M。

1.2 動物分組 健康SD大鼠12只，雄性，體質(zhì)量250～300 g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，耳廓反射正常，聽性腦干反應(auditory brainstem response，ABR)檢查示雙耳聽力正常。將大鼠隨機分為兩組:實驗組6只，經(jīng)耳蝸中階側(cè)壁行EGFP慢病毒顯微注射;對照組6只，經(jīng)耳蝸中階側(cè)壁行人工內(nèi)淋巴液顯微注射。

1.3 動物手術 大鼠用氯胺酮(40 mg/kg)和氯丙嗪(15 mg/kg)行大腿肌肉注射麻醉后，取頭上腳下位側(cè)俯臥于自制加熱平板上并維持溫度在37℃左右，頭偏右側(cè)使左耳向上。行耳后備皮后，碘伏消毒，手術器械術前經(jīng)高溫滅菌消毒。沿耳廓后溝2 mm處4點到7點的位置弧形剪開皮膚及皮下組織，向下分離腺體后剪開頸闊肌，用自制拉鉤拉開切口，向深處鈍性分離可見胸鎖乳突肌，向上牽開胸鎖乳突肌后，可見面神經(jīng)和二腹肌后腹(封2圖1a);向后分離并牽開二腹肌后腹，在面神經(jīng)和二腹肌圍成的三角區(qū)域內(nèi)向深處分離并去除聽泡外側(cè)壁覆蓋的軟組織和筋膜，可暴露聽泡外側(cè)壁(封2圖1b);沿聽泡后外側(cè)磨除骨壁并擴大，可暴露鐙骨動脈、圓窗龕、耳蝸外側(cè)壁(封2圖1c);在耳蝸底周外側(cè)壁色素沉著區(qū)，盡量遠離鐙骨動脈和便于操作處確定開孔口，用三棱針穿破耳蝸中階外側(cè)壁骨質(zhì)，再用細塢針穿破內(nèi)壁軟組織膜，可見少許血液和清亮的淋巴液流出，將微量操縱器上固定的玻璃微電極導入開孔口，用5 min將EGFP慢病毒或人工內(nèi)淋巴液5μL緩慢注入耳蝸中階(封2圖1d);完成后以自體小塊頸闊肌覆蓋，再用牙科水門汀覆蓋頸闊肌，封閉耳蝸開孔口，行中耳腔碘伏清洗消毒后，用少許明膠海綿填塞中耳腔;復位肌肉和軟組織，分層縫合切口。縫合口處以乙醇消毒。待大鼠清醒后，回籠中喂養(yǎng)。術后肌注青霉素20萬IU/d，連續(xù)3 d。

1.4 ABR檢測 于動物手術前和手術后3周在動物處死前行ABR測試。采用Nicolet Compass系統(tǒng)，刺激聲為短聲，時程0.1 ms，重復率為 11.1次/秒，濾波帶寬 150～2000 Hz，疊加1000次，掃描周期10 ms。采用銀絲電極，正極插入頭頂正中皮下，參考電極插入檢測耳頜面部皮下，地極電極插入對側(cè)耳頜面部皮下。刺激聲經(jīng)插入式耳塞給入，給聲策略采用升10降5法;以Ⅲ波消失的刺激強度確定閾值，并要求至少能重復1次。

1.5 標本取材和制備 術后3周，待ABR檢測完后，將兩組大鼠斷頭立即取出耳蝸，挑開蝸尖、前庭窗和蝸窗，從蝸尖灌注4%多聚甲醛至無血性物流出，并在4%多聚甲醛中4℃下固定過夜，再以20%EDTA脫鈣2周后，20%蔗糖脫水，OCT包埋，沿蝸軸水平行冰凍切片。整個過程注意避光操作。

1.6 熒光顯微鏡觀察 切片以PBS洗3遍，20%甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.7 統(tǒng)計學方法 全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，結(jié)果以表示。ABR閾值比較采用配對 t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般情況 兩組術中、術后均無動物死亡。術后大鼠無明顯歪頭、斜頸、行走不穩(wěn)、面癱、食欲減退及切口感染等癥狀。術后3周手術耳聽泡打開后未見化膿感染，明膠海綿有少量殘余，耳蝸開窗處可見白色的牙科水門汀封閉，未見明顯異常。

2.2 ABR閾值的變化 手術后實驗組大鼠的手術耳ABR閾值提高(55.8±4.9)dB SPL;對照組大鼠的手術耳ABR閾值提高(56.7±6.1)d B SPL;兩組大鼠手術耳的ABR閾值比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);兩組大鼠的非手術耳在手術前、后ABR閾值無明顯變化;兩組大鼠的手術耳，在手術后聽力均高于手術前，且差異有統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 兩組大鼠手術前、后ABR(click)閾值(dB SPL)

2.3 耳蝸內(nèi)EGFP慢病毒的表達 在熒光顯微鏡下可見，術后3周實驗組可見耳蝸內(nèi)有EGFP的綠色熒光表達，其主要位于耳蝸中階的血管紋邊緣細胞、Corti器、螺旋神經(jīng)和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞等部位;對照組的耳蝸內(nèi)無EGFP的綠色熒光表達(封2圖 2)。

3 討 論

在外周性感音神經(jīng)性聾動物模型的活體實驗中，如何經(jīng)耳蝸快速成功地導入基因或細胞是實驗的關鍵。大鼠由于其基因組與人類的同源基因組相似，成為進行內(nèi)耳研究的常用對象[6]。另外大鼠的手術耐受性和抗感染能力均強于小鼠，故本實驗選取大鼠為研究對象。大鼠麻醉對手術的順利進行顯得很重要，氯胺酮和氯丙嗪的復合麻醉可以維持2 h左右，藥量不可過大，否則可致動物死亡。

在耳蝸基因?qū)胧中g的進路選擇上，國內(nèi)外較多應用的是腹側(cè)[7-8]和耳后[9]進路。大鼠聽泡的位置較深，腹側(cè)進路須經(jīng)過氣管、大的面靜脈和頸動脈分支等結(jié)構(gòu)，損傷后均可導致動物術中、術后發(fā)生死亡;而耳后進路經(jīng)過的重要結(jié)構(gòu)相對較少。本研究采取耳后進路，術中隨時以手指探觸骨性聽泡的位置，切開頸闊肌，向上牽拉胸鎖乳突肌，然后以面神經(jīng)和二腹肌后腹圍成的三角為解剖標志，即面神經(jīng)下方、二腹肌后腹的前方，進一步向深處分離骨性組織上覆著的軟組織和筋膜，即可暴露聽泡;在聽泡的前方有頸內(nèi)動脈，操作時切勿靠前損傷而導致動物死亡。聽泡開窗時位置選擇靠前外，可避免損傷耳蝸側(cè)壁和鐙骨動脈，開窗的大小以能看見耳蝸底周骨質(zhì)和鐙骨動脈為宜，不宜過大。韓朝和遲放魯[8]報道聽泡打孔的位置選擇在聽泡下壁的前偏外側(cè)，與作者觀點一致。

在耳蝸中階外側(cè)壁開孔口的定位上，作者發(fā)現(xiàn)血管紋在耳蝸側(cè)壁上呈現(xiàn)一較明顯的色素沉著區(qū)，遂以耳蝸底周外側(cè)壁色素沉著區(qū)為解剖標志帶，選取盡量遠離鐙骨動脈且便于操作處為開孔口，在顯微鏡下將EGFP慢病毒導入耳蝸中階。Iguchi等[10]報道通過觀察耳蝸骨壁色素沉著區(qū)，在該部位開孔可將細胞導入內(nèi)淋巴系統(tǒng)，這與作者的觀點一致。本實驗采用的EGFP是一種優(yōu)化的突變型GFP，將64位絲氨酸用蘇氨酸代替，65位苯丙氨酸用亮氨酸代替，使其產(chǎn)生的熒光比野生型GFP強35倍，大大增強了報告分子的靈敏度，該分子的激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為507 nm。經(jīng)中階導入后，可以發(fā)現(xiàn)在血管紋邊緣細胞、Corti器、螺旋神經(jīng)和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞等部位有EGFP的綠色熒光表達，提示可以通過慢病毒為載體，將外源基因?qū)氲紺orti器部位，更好地發(fā)揮針對Corti器損傷的基因治療。韓朝等[11]報道經(jīng)圓窗入路導入的腺病毒不能感染內(nèi)外毛細胞和支持細胞;經(jīng)耳蝸中階側(cè)壁導入的腺病毒，可以感染聽器的支持細胞和血管紋緣細胞。

耳蝸側(cè)壁開孔后，對大鼠聽功能產(chǎn)生一定的影響。本研究發(fā)現(xiàn)手術前、后實驗組大鼠 ABR閾值提高了(55.8±4.9)d B。Bogaerts等[12]報道CBA/CaH小鼠耳蝸側(cè)壁開孔術后3個月ABR閾值提高了15～45 dB，并認為聽力損失與開孔口的大小有關，小的開孔口導致小量的聽力損失，大的開孔口導致大量的聽力損失和術后轉(zhuǎn)圈行為。Iguchi等[10]報道C57BL/6小鼠耳蝸側(cè)壁開孔術后聽力損失40～70 dB，而外半規(guī)管開孔導致的聽力損失小于耳蝸側(cè)壁開孔。韓朝等[13]報道通過豚鼠耳蝸中階輸注腺病毒后，ABR閾值為(33.33±11.69)dB。作者發(fā)現(xiàn)經(jīng)耳蝸中階外側(cè)壁導入慢病毒和人工內(nèi)淋巴的大鼠，術后ABR閾值無明顯差異，提示ABR的閾值增高與導入內(nèi)淋巴的物質(zhì)無關，可能與手術和顯微注射的過程有關;韓朝等[13]也報道向豚鼠耳蝸中階輸注的不同藥物成分對其聽力造成的影響在2周時無差別，聽力損害只與灌注的機械性損傷有關。作者認為耳蝸開孔口盡可能的小，中耳操作時盡量不損傷聽小骨、鼓膜、鐙骨動脈等重要結(jié)構(gòu)，可最大限度地減少手術過程造成的聽力損失;選用可緩慢、勻速控制的顯微注射系統(tǒng)可最大限度地減少顯微注射過程造成的聽力損失。對于如何既能將基因?qū)攵佒须A、又能盡量減小聽功能的損傷還有待進一步的研究。

綜上所述，本實驗描述了一種安全、有效地將基因?qū)氪笫蠖佒须A的方法，導入的外源性基因可以在耳蝸中階的C roti器表達，為后續(xù)針對性地經(jīng)耳蝸中階導入治療基因，治療Corti器損傷的外周性感音神經(jīng)性聾提供了實驗基礎。

[1]Kawamoto K，Sha SH ，Minoda R，et al.Antioxidant gene therapy can protect hearing and hair cells from ototoxicity[J].Mol Ther，2004 ，9(2):173.

[2]Izumikawa M，Minoda M ，Kawamoto K，et al.Auditory hair cell replacement and hearing im provement by Atohl gene therapy in deaf mammals[J].Nat Med，2005，11(3):271.

[3]付勇，汪審清，王建亭，等.大鼠胚胎神經(jīng)干細胞經(jīng)蝸窗移植到正常耳蝸的研究[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2008，43(12):944.

[4]Fu Y，Wang S，Liu Y，et al.Study on neural stem cell transplantation into natural rat cochlea via round window[J].Am J Otolaryngol，2009 ，30(1):8.

[5]Ishimoto S ，Kaw amoto K，Warpeha RL，et al.Gene transfer into supporting cells of the organ of Corti[J].Hear Res，2002 ，173(1-2):187.

[6]Anson BJ，Donaldson JA ，Warpeha RL，et al.The surgical anatomy of the ossicular muscles and the facial nerve[J].Laryngoscope，1967，77(8):1269.

[7]Qiu J，Olivius P ，Tong B，etal.Ventralapproach to ratinner ear preserves cochlear function[J].Acta Otolaryngol，2007，127(3):240.

[8]韓朝，遲放魯.腺病毒載體經(jīng)豚鼠耳蝸中階導入內(nèi)淋巴系統(tǒng)的實驗觀察[J].中國眼耳鼻喉科雜志，2007，7(2):79.

[9]Lu W，Xu J，Shepherd RK.Cochlear implantation in rats:a new surgicalapproach[J].Hear Res，2005，205(1):115.

[10]Iguchi F ，Nakagaw a T ，Tateya I，et al.Surgical techniques for cell transplantation into the mouse cochlea[J].Acta Otolaryngol Suppl，2004，124(1):43.

[11]韓朝，遲放魯，楊娟梅，等.腺病毒通過不同徑路導入豚鼠耳蝸后的實驗觀察[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2009，23(13):607.

[12]Bogaerts S ，Douglas S ，Corlette T ，et al.Microsurgical access for cell injection into the mammalian cochlea[J].J Neurosci Methods，2008，168(1):156.

[13]韓朝，遲放魯，黃一波，等.注射用水及腺病毒中階輸注對豚鼠聽力的影響[J].中國眼耳鼻喉科雜志，2008，8(4):214.