蘋果酸舒尼替尼對人結腸癌細胞株LoVo的增殖抑制作用

盧康榮，周 婭，杜 瑋，王萬山

(1.南方醫科大學教育部/廣東省共建“重大疾病的轉錄組與蛋白質組學重點實驗室”，廣州 510515;2.廣州軍區聯勤部衛生部 510063;3.廣州軍區廣州總醫院 510010;4.南方醫科大學比較醫學研究所，廣州 510515)

蘋果酸舒尼替尼(sunitinib malate，S U11248)是一種高選擇性多靶點小分子蛋白激酶抑制劑，2006年獲得美國食品與藥品監督管理局(FDA)批準上市，主要用于治療轉移性腎細胞癌(RCC)和不能耐受或伊馬替尼治療失敗的轉移性胃腸道間質瘤(GIST)。Sunitinib能抑制多種信號通路，同時具有抗血管生成和抗腫瘤增殖的活性。對血小板衍生生長因子受體(PDGFR)α、β，血管內皮生長因子受體(VEGFR)1、2、3，干細胞生長因子受體(c-kitR)，FMS酪氨酸激酶-3(Flt-3)，集落刺激因子受體1(CSF-1R)和膠質細胞源性神經營養因子受體(RET)等多種受體酪氨酸激酶均有抑制作用。

以往研究顯示，Sunitinib具有廣譜的抗腫瘤活性，在非小細胞肺癌、乳腺癌、腎癌、黑色素瘤、神經膠質瘤、鱗狀上皮細胞癌模型中，Sunitinib有抑制腫瘤細胞生長和轉移的作用[1-3]。本實驗將Sunitinib作用于人結腸癌細胞株LoVo，利用四亞基噻唑藍(M TT)法和臺盼藍拒染法檢測其生長抑制作用，并用流式細胞儀檢測細胞周期，電鏡觀察細胞凋亡情況，以此探討Sunitinib對結腸癌細胞的殺傷作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌Lo Vo細胞由南方醫科大學珠江醫院腫瘤科提供，常規培養于 RPMI-1640完全培養基內，置于37℃、50 m L/L CO2的濕化環境中培養。Sunitinib購自輝瑞公司。MT T、碘化丙啶(PI)和二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司。胰蛋白酶購自美國Amresco公司，胎牛血清購自GIBCO公司。順鉑(C-DDP，20 mg/支)購自錦州九泰藥業有限責任公司，其他常用化學試劑購自廣州化學試劑廠。酶標儀(STA T FAX-2100)購自廣州倍威儀器有限公司，另外還有透射電子顯微鏡HITACHI H-7500、流式細胞儀BD FACSAria等。

1.2 M TT法測定細胞抑制率 取對數生長期的細胞，用25 g/L的胰酶消化后，離心后計數，用含100 m L/L胎牛血清的RPMI-1640培養基配成5×104個/m L的細胞懸液，接種在 96孔板中，每孔接種 200μL，每組設 6個復孔，置于37℃、50 m L/L CO2的細胞培養箱中培養24 h。待細胞貼壁，再按要求加入不同濃度的藥物，培養48 h后，每孔加入20μL含 20 mmol M TT，繼續培養4 h后，吸去培養孔中的液體，每孔加入150μL DMSO，在微量振蕩器上振蕩10 min。然后在酶標儀上以570 nm的波長測定光密度值A值。結果判定:細胞生長抑制率=[(空白對照組孔平均A值-實驗組孔平均A值)/空白對照組孔平均A值]×100%。將Sunitinib的濃度分別設為1.25、2.5、5、10、20 μM ，實驗設立陽性和陰性對照組。

1.3 臺盼藍拒染法測定生長曲線 將細胞用100 m L/L胎牛血清、RPMI-1640培養基配成100×104個/m L的細胞懸液，然后接種在96孔培養板上，每孔200μL，實驗組加入不同濃度的受試藥物，空白對照組加入等體積的溶劑，每個濃度設置6個復孔，置于37℃、50 m L/L的CO2的細胞培養箱中培養24 h后，按照空白對照組和實驗組給予處理。然后予 0、1、2、3、4、5、6 d各取樣40μL，加入 4 m L/L 臺盼藍液 10 μL，計數細胞數。每孔計數3次，取均值，再累計5孔均值，根據細胞濃度值的對數值與時間作用繪圖，即為細胞生長曲線，實驗重復3次。陽性對照組設為順鉑 10μg/m L。

1.4 流式細胞儀測細胞周期 實驗分為實驗組(2.5、5、10、20 μM)和陰性對照組(加入等量的生理鹽水)。以5×104個/mL的細胞密度接種于6孔板上，待細胞增殖至80%融合時給予藥物刺激。作用24 h后用胰酶消化細胞，2000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞，用 D-Hanks′液清洗2次，離心，70%乙醇4℃固定。將固定的細胞以4000 r/min離心5 min，用D-Hanks′液清洗 1～2次，沉淀物懸浮于 0.5 m L的PI和5μL的RNase酶中，避光放置染色30 min，200目篩網過濾。用流式細胞儀作DNA周期分析。

1.5 透射電鏡觀察凋亡細胞形態 以5×104個/mL的細胞密度接種于10 cm的培養皿中，待細胞增殖至80%融合時，加入實驗藥物，使其終濃度為10μM ，作用24 h后，消化，收集細胞，用D-Hanks′液漂洗，1200 r/min離心 10 min，細胞團塊用2.5%戊二醛固定2 h，再用1%鋨酸固定 1 h，常規梯度脫水，醋酸鈾染色，EPON 812包埋，超薄切片，經檸檬酸鉛染色后封片，透射電鏡下觀察、照相。

2 結 果

2.1 Sunitinib對Lo Vo細胞抑制作用的觀察 濃度為1.25、2.5、5、10、20μM 的Sunitinib作用于腫瘤細胞后的M TT結果顯示:該藥對Lo Vo細胞有明顯的生長抑制作用，在10μM 濃度處細胞抑制率已經達到65.81%，且有明顯的劑量效應關系，相關系數為 r=0.694(P＜0.004)。20μM 的抑制率反而不高，可能與藥物濃度過大有關(表1)。

2.2 Sunitinib對LoVo細胞抑制作用的時間效應關系觀察生長曲線顯示，Sunitinib的各個濃度對腫瘤細胞生長均有抑制作用，其中以24 h的抑制作用最為明顯。尤其在10～20μM濃度范圍內抑制作用較為明顯(圖1)。

2.3 流式細胞儀觀察 用不同濃度的Sunitinib處理24 h后，Lo Vo細胞周期各個時相分布也相應發生改變，處于G0/G1期的細胞比例隨著 Sunitinib作用濃度的升高而增加，當Sunitinib的濃度為10μM時，G0/G1期細胞達63.6%，而陰性對照組(未加 Sunitinib處理組)24 h后G0/G1期細胞僅為46.8%，與用藥組比較，差異有統計學意義(P＜0.01);S期細胞的比例則隨Sunitinib作用濃度的增加呈現遞減趨勢。表明Sunitinib使LoVo細胞阻滯在G0/G1期(表2)。

表1 Sunitinib對結腸癌LoVo細胞生長的抑制作用(，%)

表1 Sunitinib對結腸癌LoVo細胞生長的抑制作用(，%)

Sunitinib濃度(μg/m L)IR C-DDP Sunitinib 1.25 0 16.19±0.1242.5 20.34±0.027 23.81±0.219558.65±0.014 41.06±0.14910 67.04±0.048 65.81±0.24620 53.13±0.034 58.68±0.028

圖1 Sunitinib對結腸癌LoVo細胞作用的生長曲線

表2 不同濃度的Sunitinib對LoVo細胞周期的影響(，%，n=6)

表2 不同濃度的Sunitinib對LoVo細胞周期的影響(，%，n=6)

與空白對照組比較，*:P＜0.01。

組別 細胞凋亡率細胞周期G0/G1 S G2/M空白對照組 0 46.8±1.32 49.7±0.21 2.41±0.28 Sunitinib濃度(μg/mL)1.25 14.3±0.58*62.7±5.54* 9.1±4.34* 8.4±5.12*2.5 16.7±0.69*61.5±5.56* 8.4±3.67* 8.2±7.981*519.0±0.73*63.2±5.42* 7.5±5.12* 8.1±6.98*10 21.3±0.83* 63.6±6.21* 7.4±4.67* 5.7±6.54*20 25.6±0.74* 65.5±6.28* 7.9±4.32* 8.1±5.21*

圖2 10μM Sunitinib作用于 Lo Vo細胞24 h后的電鏡圖像

2.4 透射電子顯微鏡觀察 10μM Sunitinib作用于LoVo細胞24 h后，細胞發生凋亡，體積縮小，胞膜完整但發生皺縮，細胞核固縮，核內染色質向核膜邊緣凝聚、固縮、邊聚(圖2)。

3 討 論

受體酪氨酸激酶(RTK)屬于Ⅲ和Ⅴ類裂解激酶域家族成員，它們的功能異常與多種實體瘤和造血系統惡性腫瘤的發生和發展相關。RTKs由細胞外的配體結合域和細胞內的催化結構域構成。RTK受體與配體結合后，受體寡聚化，并且自磷酸化而激活下游信號通路。該信號傳導的級聯反應最終促使細胞存活和增殖，如腫瘤細胞通過分泌VEGF和PDGF直接作用于內皮細胞促進血管新生，使腫瘤生長、增殖和轉移。Sunitinib能抑制體內多種受體RTK的磷酸化作用，特別是對與腫 瘤相關 的受 體 RTK、PDGFR、RET、KIT 等，以 及PDGFRβ-和 VEGFR2-依賴的腫瘤血管生長因子顯示很強的抑制作用，對腫瘤生長和轉移顯示抑制作用[3-4]。2006年1月FDA批準舒尼替尼用于治療轉移性腎細胞癌和不能耐受或伊馬替尼(甲磺酸伊馬替尼、imatinib mesylateG、Gleevec)治療失敗的胃腸道間質瘤(GIST)患者。實驗顯示，在放、化療同時加用舒尼替尼有助于增強放、化療的抗腫瘤效應[5]。

本實驗應用Sunitinib作用于人結腸癌細胞，觀察其對Lo-Vo細胞的生長抑制作用。實驗結果顯示在1.25～20μM的濃度范圍內對LoVo細胞有不同程度的抑制作用，體外實驗藥物作用濃度范圍對臨床用藥選擇最佳給藥濃度具有借鑒意義。細胞生長曲線除了顯示Sunitinib有較明顯的生長抑制作用外，還較直接地反映了其對腫瘤細胞生長抑制的動態變化情況。細胞凋亡是一個細胞主動參與的復雜的病理生理過程，近年來的研究表明，許多抗腫瘤藥物可以誘導腫瘤細胞凋亡，可能是抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞生長的機制之一。化療藥物主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡來達到治療目的，腫瘤細胞對化療藥物的敏感性決定了化療的效果。本研究中Sunitinib作用于Lo Vo細胞后，電鏡觀察結果顯示細胞體積縮小，胞膜完整但發生皺縮，細胞核固縮，核內染色質向核膜邊緣凝聚、固縮、邊聚等凋亡的特異性變化。流式細胞儀還觀察到Sunitinib對腫瘤細胞DNA合成期及G2/M期的阻滯。

細胞凋亡是基因導向的細胞自我消滅的過程，通過細胞內的核酸內切酶，使核小體間的DNA裂解成碎片，繼而核裂解，導致細胞死亡。它是通過外源性或內源性的凋亡信號，激活細胞內編碼的自殺程序而促發的[6-7]。本實驗觀察到Sunitinib對結腸癌細胞的抑制作用可能是通過誘導細胞凋亡實現的。

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