嗜酸乳桿菌的亞油酸異構酶基因克隆及其pMG36e表達載體的構建

郎建華 趙國芬 李志剛 鄭 婷 包秋華

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是亞油酸(linoleic acid，LA)衍生的共軛雙烯酸的多種位置與幾何異構體的總稱。其中cis-9、trans-11和trans-10、cis-11兩種異構體被證實具有很強的生理活性，具有抗動脈粥樣硬化、降低膽固醇、抗氧化、減肥、促進生長、緩和免疫反應副作用等優點。

20世紀80年代起，人們開始逐漸了解到，一些微生物細胞中的亞油酸異構酶 (linolenic acid isomerase,LAI)可催化亞油酸轉化為共軛亞油酸的反應，并且反應產物均為活性共軛亞油酸異構體。亞油酸異構酶最早發現于溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）中，之后，又發現痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes）、棒桿菌（Cornebacterium ssp）等能產生亞油酸異構酶。目前，有些菌種的亞油酸異構酶已被分離純化。然而，這些菌種有些是厭氧的，不利于進行大規模的產酶培養；有些兼性厭氧菌生長較為緩慢，且生長會受到共軛亞油酸產物的抑制，并且傳統的CLA工業生產大多采用化學方法,存在產物難以分離、產物中含有環化副反應、產品安全性低等問題，尚無法實際應用。于是，構建基因工程菌來表達亞油酸異構酶，就成為工業發酵生產共軛亞油酸的一條重要途徑。

一些研究者開始將注意力轉移到一些厭氧條件相對不是很嚴格的菌種，并陸續發現一些具有共軛亞油酸轉化能力的兼性厭氧微生物，尤其是乳酸菌的研究和應用價值逐漸顯現出來，目前，人們已發現乳酸桿菌屬的多個種，如嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）、德氏乳酸桿菌保加利亞亞種（L delbrueckii subsp bulgaricus）、德氏乳酸桿菌亞種（L delbrueckii subsp Lactic）、羅伊氏乳桿菌（L reuteri）、干酪乳桿菌（L casei）、植物乳桿菌（L plantarum）,以及和乳桿菌密切相關的乳球菌屬（Lactococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和丙酸桿菌屬（Propionibacterium）的多個種都具有亞油酸異構酶活性。曹健、相麗新（2007）等已對嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的亞油酸異構酶基因克隆及表達進行了研究。

本實驗將用嗜酸乳桿菌基因組為模板對LAI基因進行PCR擴增，之后克隆入pMD-19T質粒，再亞克隆到pMG36e質粒中，構建乳酸菌表達載體pMG36e-LAI，并轉化到DH5 α中,為利用工程菌工業化生產高產量、高活性亞油酸異構酶制劑來生產CLA奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)為本實驗室從益生菌酸奶發酵劑中分離出的菌株。E.coli JM109，為內蒙古農業大學分子生物實驗室保存，用于質粒pMG36e及其衍生質粒的保存。E.coli JM109（pMG36e）為內蒙古農業大學乳品樓生物實驗室贈送。

1.1.2 培養基

LB培養基按照分子克隆實驗指南進行配制。

1.1.3 酶及生化試劑

所用限制性內切酶SalⅠ、SphⅠ、異丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、X-Gal為大連寶生物公司產品。T4DNA連接酶、EX Taq DNA聚合酶、紅霉素均為TaKaRa公司產品。

膠回收試劑盒為北京中科瑞泰公司產品，質粒抽提試劑盒為Tian Gen公司產品。DNA連接試劑盒、pMD19-T試劑盒、DNA Marker均為大連TaKaRa公司產品。

1.1.4 主要試劑及溶液

Tris-HCl緩沖液(pH值8.0)、TE緩沖液(pH值8.0)、溶菌酶(20mg/ml)、SDS(10%、50 μl)、蛋白酶 K、NaCl(5 M100 μl)、CTAB/NaCl（10%/0.7 M）、酚/氯/異戊醇（25： 24： 1）、氯仿/異戊醇（24： 1）、預冷異丙醇 、預冷乙醇（70%）、氯化鈣 。

1.1.5 引物

根據從國際基因庫（Gen Bank）中下載的多條LAI基因序列，并結合國內董理等人的報道，利用Primer 5.0軟件，針對pMG36e質粒的多克隆位點，設計了一對PCR擴增引物：

上游引物P1：

5'—AAAGTCGACATGTATTATTCCAAT-3'，（下 劃 線為SalⅠ酶切位點）；

下游引物P2：

5'—AAAGCATGCTTAGACTAAATTTGCTTC-3'，（下劃線為SphⅠ酶切位點）。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌總DNA的提取

用CATB法提取。

1.2.2 嗜酸乳桿菌LAI基因的PCR擴增

PCR反應條件：94℃預變性3 min，循環條件為：94℃變性30 s，47℃退火 45 s，72℃延伸2 min；循環30輪后，72℃保溫6 min并終止反應。

1.2.3 LAI基因PCR產物的克隆及鑒定

用膠回收試劑盒純化LAI基因PCR產物后和pMD19-T載體連接，轉化用氯化鈣法制備的感受態E.coli DH5 α，對陽性克隆用菌落PCR篩選及酶切鑒定。

1.2.4 LAI基因測序和氨基酸序列推測

篩選出含陽性克隆質粒pMD19-T-LAI的陽性菌，送北京三博遠志有限公司進行序列分析并預測其氨基酸序列。

1.2.5 LAI基因新型表達載體的構建及轉化

將LAI基因從pMD-19T-LAI克隆質粒上用SalⅠ、SphⅠ限制性內切酶切下，重新對應連接到用相同內切酶雙酶切后的大腸桿菌/乳酸菌表達載體pMG36e上，并將重組質粒pMG36e-LAI轉入E.coli DH5 α。

1.2.6 新型表達載體pMG36e-LAI的鑒定

挑選出轉化平板上陽性菌落，并通過PCR擴增進行陽性克隆的初步篩選，然后提取陽性克隆的質粒進行雙酶切分析。

2 實驗結果與分析

2.1 LAI基因的PCR擴增

用針對LAI基因設計的特異性引物以嗜酸乳桿菌基因組為模板進行PCR擴增，電泳結果如圖1所示，2號泳道得到一條長約1.8 kb的特異性目標帶，符合LAI基因的預期長度（1 776 bp）。

圖1 嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因的PCR擴增

2.2 LAI基因的克隆及酶切鑒定

圖2 陽性克隆菌液PCR檢測結果

圖3 Sal I、Sph I雙酶切電泳檢測結果

將大量PCR產物電泳、凝膠回收并純化后，直接與pMD-19T (2 692 bp)載體連接，然后轉化E.coli DH5α，通過藍白斑篩選，挑取白色陽性克隆菌。陽性克隆菌落PCR結果見圖2。圖2中1、3、4號泳道均得到一條長約1.8 kb的特異性條帶，與預期的相同；提取其質粒SphⅠ、SalⅠ雙酶切后，電泳檢測結果見圖3。圖3中2、3號均為陽性克隆質粒（pMD-19TLAI）經過雙酶切后，得到約1.8 kb和2.7 kb左右的片段，與我們插入的片段(1 776 bp)和質粒pMD-19T大小一致，1號為pMD-19T-LAI質粒，大小為4.4 kb，與預期的相符。證明陽性克隆質粒pMD-19T-LAI構建成功。

2.3 亞油酸異構酶基因測序及其氨基酸序列預測

將陽性克隆菌DH5 α(pMD-19T-LAI)提交北京三博遠志公司進行克隆片段序列測定。

LAI基因序列測定及分析表明，ORF全長1 776 bp，編碼591個氨基酸，編碼蛋白的相對分子質量約67.6 kDa。

將該測定序列與Gen Bank中登錄號為CP000033的嗜酸乳桿菌NCFM菌株的亞油酸異構酶基因序列進行比對，結果表明，該菌株亞油酸異構酶基因的核苷酸序列與NCFM中的核苷酸序列長度相同，都是1 776 bp，編碼591個氨基酸，兩段序列中在1 338位置有1個堿基不同，同源性高達99%，但所編碼的氨基酸序列并沒發生變化。

該基因測定序列與Gen Bank中登錄號為DQ239438的嗜酸乳桿菌AS1.1854菌株的亞油酸異構酶基因序列進行比對，結果表明，該菌株亞油酸異構酶基因的核苷酸序列與AS1.1854中的核苷酸序列長度相同，都是1 776 bp，編碼591個氨基酸，兩段序列中有4個堿基不同，同源性高達99%，導致所編碼的氨基酸序列發生了變化。差別為該菌株編碼的氨基酸序列第157為E(谷氨酸)，第286為F（苯丙氨酸），第506為V（纈氨酸）；而AS1.1854菌株編碼的氨基酸序列對應的為G（甘氨酸）、C(半胱氨酸)、A（丙氨酸）。其中G和E，以及C和F兩對氨基酸的極性不同，而A和V極性相同。

對該嗜酸乳桿菌和AS1.1854所編碼氨基酸序列用Bioediter7.0進行疏水性分析,結果見圖4。由于兩蛋白質間只存在3個氨基酸的差別，因此，其疏水性譜非常相似,在兩序列的N端均有一疏水區，可能存在信號肽。

圖4 嗜酸乳桿菌株(a)和AS1.1854(b)亞油酸異構酶基因氨基酸疏水輪廓平均數圖譜(Bioediter7.0)

2.4 LAI基因新型表達載體的構建及鑒定

圖5 陽性克隆菌落PCR電泳結果

圖6 雙酶切質粒pMG36e-LAI電泳檢測結果

將Sph I和Sal I限制性內切酶雙切后得到的LAI基因和pMG36e電泳、回收、純化、連接后轉化感受態的E.coli DH5α，挑白色菌落進行PCR，結果如圖5，1、2、3號泳道均得到1.8 kb的片段，與目的片段大小相同；提取陽性克隆質粒pMG36e-LAI進行雙酶切結果如圖6，圖6中2號泳道出現了1.8 kb和3.4 kb左右的酶切片段，分別與目的片段 (1 776 bp)和pMG36e大小相同。圖5和圖6表明重組表達載體pMG36e-LAI構建并轉化成功。

3 討論

通過設計特異性引物擴增并克隆的LAI基因與現有報道的LAI序列高度相似，同源性為99%，可能是地域差異或不同亞種引起的，但預測的氨基酸順序和疏水性分析表明，該氨基酸序列與報道的氨基酸序列一致。可以預測這個堿基的改變不會引起LAI基因功能的改變。

曹健等（2007）也對亞油酸異構酶基因進行了克隆與表達，不同的是他們利用的是嗜酸乳桿菌AS1.1854菌株，表達載體是pET30a，轉入到大腸桿菌BL21株中表達,在低溫下誘導表達出重組蛋白,首次表達出了可溶性的亞油酸異構酶。

相麗新等（2007）利用植物乳桿菌 AS1·555,也克隆了亞油酸異構酶，并將其克隆到pQE30質粒載體上,進行測序，結果表明與已報道的痤瘡丙酸桿菌共軛亞油酸異構酶分子量(55 ku)相差較大,但與羅伊氏乳桿菌(70 ku)和短雙歧桿菌(70.5 ku)相近，其氨基酸序列與羅伊氏乳桿菌共軛亞油酸異構酶只有32%的同源性,與痤瘡丙酸桿菌則沒有顯著同源性，說明了不同來源的共軛亞油酸異構酶可能也存在物種多樣性或多形性。

4 結語

目前已成功構建大腸桿菌pMG36e-LAI新型表達載體，如果能成功在大腸桿菌中高效表達，可嘗試轉入乳酸菌工程菌MG1363，并獲得大量表達，將為利用乳酸菌作為工程菌工業化生產獲得大量、高活性亞油酸異構酶制劑，以及為研制多功能微生態制劑奠定基礎，也為進一步構建食品級表達載體獲得可食用益生菌劑提供理論依據。

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