植酸酶的高密度發(fā)酵、制備及其應用研究

龍 躍 楊 博 王永華 吳曉英 齊振雄

植酸酶是催化植酸及其鹽類水解成肌醇和磷酸的一類酶的總稱。磷是動物體內一種必需的礦物質，在參與體內正常的新陳代謝中起著重要的作用。磷還是骨骼的重要成分。畜禽必須從飼料中攝取足夠的磷,才能維持正常的生命活動。如果飼料中缺磷，會導致畜禽生長發(fā)育遲緩，骨骼和牙齒發(fā)育不良，動物生產性能降低等不良后果。在飼料中添加植酸酶,可以提高飼料的利用率,降低飼料系數和飼料成本,改善許多水產動物的生長性能,促進其生長,所以植酸酶的應用潛力很大。飼料中添加植酸酶可以減少磷酸二氫鈣的添加量,從而減少了磷源的浪費,同時降低了磷的排泄量,進而減少了磷對水體環(huán)境的污染。

巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)是目前最優(yōu)秀、應用最廣泛的外源基因表達系統(tǒng)之一。它不但克服了大腸桿菌表達系統(tǒng)不能表達結構復雜的蛋白質，表達的蛋白多形成包涵體，背景蛋白多，表達量不很高等缺陷，還具有與真核生物極其相似的分泌途徑和很強的真核蛋白質修飾功能,并且其自身分泌的蛋白質很少且易于高密度發(fā)酵,因此，在表達和分離純化異源蛋白質等方面具有很強的優(yōu)勢。本研究主要是對本實驗室保存的畢赤酵母產植酸酶基因工程菌的發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化研究，確定產酶的最佳發(fā)酵條件,初步研究酶學特性，并且投入小規(guī)模的實際應用，為今后大規(guī)模工業(yè)化生產植酸酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

巴斯德畢赤酵母基因工程菌，甲醇營養(yǎng)型，由華南理工大學生物科學與工程學院生物化工實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:YPD液體培養(yǎng)基；固體平板培養(yǎng)基：液體YPD培養(yǎng)基加2%瓊脂；搖瓶生長培養(yǎng)基：BMGY；搖瓶甲醇誘導表達培養(yǎng)基：BMMY；發(fā)酵生長培養(yǎng)基：26.7 ml/l 85%磷酸、0.93 g/l CaSO4·2H2O、18.2 g/l K2SO4·2H2O、14.9 g/l MgSO4·7H2O、7.13 g/l KOH、40 g/l甘油、4.35 ml/l微量元素；補料生長培養(yǎng)基：50%甘油、12 ml/l微量元素；誘導表達培養(yǎng)基：100%甲醇、12 ml/l微量元素；微量元素：6 g/l CuSO4·5H2O、0.08 g/l NaI、3 g/l MnSO4·H2O、20 g/l ZnSO4·7H2O、65 g/l FeSO4·7H2O、0.5 g/l CoCl2·6H2O、0.02 g/l硼酸、5 ml/l濃硫酸（上述培養(yǎng)基均按“Invitrogen Pichia Fermentation Process Guidelines”推薦方法配制）。

1.3 實驗方法

1.3.1 搖瓶發(fā)酵

將菌種接于YPD平板，30℃培養(yǎng)2 d，4℃保藏；在平板上挑取單菌落接種至液體100 ml YPD中，28～30℃、250～300 r/min搖至菌體濃度OD600=2～6(對數生長，大約16～18 h)；按10%接種量接種100 ml BMGY搖瓶中，28～30℃、250～300 r/min培養(yǎng)18～24 h；室溫1 500～3 000 g離心5 min收集細胞，去除上清，用相同體積BMMY重懸細胞，進行誘導表達，加蓋兩層滅菌紗布或干酪包布，放入搖床28℃中繼續(xù)生長。每隔24 h，加入甲醇至終濃度為1%以繼續(xù)誘導。檢查培養(yǎng)基的量，確保正確加入甲醇，因為蒸發(fā)作用會減少培養(yǎng)基的體積，誘導72 h后取樣測酶活力。

1.3.2 發(fā)酵罐發(fā)酵

種子制備：從YPD平板挑取單菌接種到100 ml種子培養(yǎng)基中，28～30℃、250～300 r/min培養(yǎng)16～18 h，做為一級種子；按10%接種量接入200 ml種子培養(yǎng)基中,28～30℃、250～300 r/min培養(yǎng)24 h，做為二級種子。

發(fā)酵罐準備：30 L發(fā)酵罐中，裝入發(fā)酵生長培養(yǎng)基，按10%接種量將二級種子接種在28℃進行菌體生長培養(yǎng)，培養(yǎng)20 h，以18 ml/(L·h)流加50%甘油作為碳源補加4 h，使菌體達到一定的濃度，通過流加甲醇的補料方式，維持DO≥20%并且在26℃下進行誘導產酶。pH值用氨水和磷酸調節(jié)。每隔4～6 h取1 ml培養(yǎng)基至1～5 ml離心管，室溫用水平離心機最大轉速離心2～3 min。這些樣品用于分析表達水平及確定誘導后收集細胞的最佳時間。

1.3.3 酶活測定方法

酶活定義：樣品在植酸鈉濃度為5.0 mmol/l，溫度37℃，pH值5.50的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1 μmol無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 甲醇添加量對表達量的影響

將10 ml菌液接入100 ml生長培養(yǎng)基BMGY中培養(yǎng)24 h，離心后將菌體轉入相同體積含有甲醇百分比濃度分別為 0.5%、1%、1.5%、2%的誘導培養(yǎng)基BMMY上進行誘導培養(yǎng),24 h后補加相同濃度的甲醇,誘導培養(yǎng)72 h后產酶結果如圖1。由圖1可以看出，甲醇百分比濃度為1.5%時酶活力達到最高，但甲醇濃度較高，達到2%時，酶活力開始下降。在重組畢赤酵母的高密度發(fā)酵中,控制適宜的甲醇濃度十分重要。甲醇濃度過低，AOX1啟動子不能有效啟動,外源基因則不能高效轉錄;甲醇濃度過高,會對細胞產生毒害。因此，甲醇濃度是實現外源蛋白高水平表達的保證。

2.1.2 誘導溫度對表達量的影響

將10 ml菌液接入100 ml生長培養(yǎng)基BMGY中培養(yǎng)24 h，離心后將菌體轉入相同體積含有1%甲醇誘導培養(yǎng)基 BMMY 中,分別在 22、26、30、34 ℃的條件下誘導培養(yǎng)72 h后產酶結果如圖2。由圖2可以看出，采用不同的溫度進行蛋白誘導時，在22℃時酶活偏低，原因可能是溫度過低，抑制了細胞的活性，但26℃和30℃相比，溫度越低越有利于目的蛋白的表達，原因可能是低溫有利于降低蛋白合成速率與新生成肽鏈的折疊速率,低的蛋白合成速率及折疊速率有利于新生肽鏈的正確折疊。

2.1.3 生長時間對表達量的影響

將10 ml菌液分別接入100 ml生長培養(yǎng)基BMGY 中分別培養(yǎng) 18、20、22、24、26、28 h，離心后將菌體轉入制好的甲醇濃度1%的相同體積培養(yǎng)基BMMY中條件下誘導72 h后產酶結果如圖3。由圖3可以看出，在生長20 h后進行誘導表達植酸酶酶活力較高，24 h后酶活力呈現下降趨勢，原因可能是因為誘導前菌種處于平穩(wěn)期中后期，細胞的產酶能力減弱。

圖1 甲醇濃度對植酸酶表達的影響

圖2 誘導溫度對植酸酶表達的影響

圖3 生長時間對植酸酶表達的影響

2.1.4 發(fā)酵時間對表達量的影響

從發(fā)酵開始，每隔4 h，取發(fā)酵液樣品測其OD600值和濕重，以最大轉速離心2～3 min，保留上清液，發(fā)酵結束后測其植酸酶酶活大小，結果見圖4。由圖4可知，細胞在培養(yǎng)20 h后，進入對數生長期，經過4 h的補加甘油后，菌體密度迅速增加達到OD600=173，實現高密度發(fā)酵，在24 h，以4 ml/(L·h)的甲醇流加速度進行誘導表達，由圖4可以看出，發(fā)酵24～108 h（誘導時間0～84 h）酶活逐漸呈上升趨勢，發(fā)酵108 h（誘導時間84 h）后，雖然菌體濃度一直增大，但酶活力開始下降。隨著時間的延長，植酸酶表達水平開始下降。原因有兩點：隨著細胞的生長，細胞同時也會分泌大量的蛋白酶，表達外源細胞被水解；二是隨著發(fā)酵時間延長，受發(fā)酵條件的限制，菌體進入平穩(wěn)期后期，表達蛋白的能力逐漸喪失。

圖4 發(fā)酵時間對植酸酶表達及菌體生長的影響

2.1.5 流加甲醇補料策略對表達量的影響

在誘導補加甲醇期間，分別采用不同的補料流加策略——甲醇： 甘油為4：0、5：0、5：1、5：2、6：0，其他條件一致的情況下，結果如圖5。由圖5可知，隨著甲醇和甘油的流加速度增大，菌體濃度OD600不斷升高，在甲醇流加速度高于5 ml/(L·h)后，菌體濃度開始下降，溶氧（DO）逐漸變大，說明此時甲醇在發(fā)酵液中開始積累，對細胞的生長產生抑制作用。在誘導階段混合流加碳源過程中，甘油流速超過1 ml/(L·h)時，酶活力開始下降，但菌體濃度還是持續(xù)上升，說明甘油在發(fā)酵液中作為第一碳源首先被利用，對甲醇的誘導作用形成抑制。因此，該結果表明，最佳的誘導補料策略是混合碳源補料，并且甲醇：甘油為5：1。

2.1.6 誘導pH值對表達量的影響

用氨水和磷酸調節(jié)誘導期的pH值，取不同水平為 5.5、5.0、4.5、4.0、3.5，其他條件一致。結果如圖 6。由圖6可知，隨著誘導期pH值的變小，菌體濃度OD600也不斷降低，但是酶活力的曲線呈先增大后變小的趨勢，說明在pH值為4.0～5.0之間，較低的pH值不適合細胞生長，但有利于植酸酶的表達，原因是誘導劑甲醇對細胞有一定的毒性，不利于高密度的發(fā)酵，但是低pH值抑制了蛋白酶的活性，提高了單位酶活力。在pH值低于4.0的情況下，由于細胞總濃度的偏低，導致了單位酶活的降低，pH值為4.0時的植酸酶活性比pH值為4.5時的植酸酶活性提高了近20%，因此，既利于生長又利于植酸酶表達的pH值為4.0左右。

圖5 甲醇補料策略對植酸酶表達及菌體生長的影響

圖6 誘導pH值對植酸酶表達及菌體生長的影響

2.2 植酸酶的酶學特性及制備

2.2.1 植酸酶的最適pH值和溫度耐受性

將產酶菌種誘導84 h后，取培養(yǎng)液離心，上清液進行酶活性檢測。酶活檢測底物為植酸鈉，用一系列緩沖溶液配制，pH值范圍為3～10，結果如圖7所示，植酸酶在pH值3～6之間能保持55%以上的活力，pH值為5時，酶活力最高。植酸酶在最適pH值下，活性中心的各個氨基酸殘基側鏈質子化或去質子化解離較容易，使得催化反應能迅速、高效進行。過酸或過堿都會對酶活性中心氨基酸殘基側鏈的解離程度造成影響,阻礙反應的順利進行。

分別將酶液在50～90℃條件下進行10 min耐熱性處理后進行酶活性檢測，如圖8。由圖8可以發(fā)現，在50～70℃內酶活力逐漸下降，而在70～90℃酶活力開始上升，并且在90℃時能保持75%的酶活力，具有良好的高溫耐熱性。飼料加工需經過制粒工藝，在制粒過程中有一個短暫的高溫過程，一般的植酸酶活性在此高溫下大幅度地不可逆喪失，所以飼料中真正得到推廣利用的植酸酶必須具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖8 不同溫度下植酸酶的耐熱性能

2.2.2 不同濃縮方法對植酸酶活力的影響

硫酸銨沉淀法：取酶液，緩慢加入研磨的硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，待硫酸銨全部溶解后繼續(xù)攪拌10～15 min，使硫酸銨的飽和度分別達到20%、30%、40%、50%、60%，10 000 r/min離心 20 min，沉淀用適量乙酸緩沖液溶解后，測其植酸酶酶活，酶活損失都在50%以上。

超濾法：將發(fā)酵后的液體用水平離心機，4℃、11 000～12 000 r/min離心10～15 min后，取上清液，經過30 kD的膜包超濾濃縮，工藝流程如圖9。超濾后的酶液體積為超濾前的1/10，單位酶活提高了大約9倍，損失率小于10%。

圖9 植酸酶后處理工藝流程

2.2.3 不同穩(wěn)定劑對植酸酶穩(wěn)定性的影響

將金屬離子、陰離子、多糖、多元醇和表面活性劑等復合穩(wěn)定劑處理濃縮后的植酸酶并進行飼料加工。分別將未處理和處理后獲得的飼料放在編織袋中，取剛加工后、保存1個月及2個月后飼料中的樣品檢測植酸酶的活性，與加入飼料前測定的活性比為其在飼料中保存的活性存留率，結果如圖10所示，添加穩(wěn)定劑可增加植酸酶的穩(wěn)定性，保存2個月后酶活存留率仍有50%以上。鹽的添加能顯著改善酶的穩(wěn)定性，鹽類主要存在離子鍵作用，當酶的活性中心含有離子作為配位體時，鹽離子就能穩(wěn)定酶的構象并且可作為水分子的替代物占據水的位置，排除自由水對酶造成的不穩(wěn)定化影響。而多羥基化合物既可通過氫鍵與酶蛋白表面分子相連結，也能通過氫鍵有效地與外部水分子相連結，使酶蛋白分子穩(wěn)定。

圖10 復合穩(wěn)定劑對植酸酶穩(wěn)定性的影響

2.3 植酸酶在草魚養(yǎng)殖中的應用

酶液經濃縮，添加穩(wěn)定劑后投入小規(guī)模養(yǎng)殖實驗。采用初始平均體重5.3 g的草魚作為實驗對象，平行實驗3組，每缸30尾，實驗時間56 d，根據表1的配方對比本實驗植酸酶的實際應用價值，由圖11可知，本實驗室植酸酶添加量0.08%時，單尾平均增重率達到75%，添加磷酸二氫鈣1.5%，單尾平均增重率76%，基本可以完全替代磷酸二氫鈣，但需進一步放大實驗確定。

表1 飼料配方（%）

圖11 不同配方對單尾平均增重率的影響

3 結論

發(fā)酵條件主要包括培養(yǎng)基、接種量、pH值、培養(yǎng)溫度、溶氧、甲醇濃度、誘導時間等,本研究以該菌株在搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化為前提的基礎上，在30 L發(fā)酵罐中進行放大優(yōu)化實驗得到最佳發(fā)酵條件為：生長時間20h、甲醇流加速度 5 ml/(L·h)、誘導期甘油流速1 ml/(L·h)、誘導pH值4，誘導時間84 h、誘導溫度26℃，酶活力可達到454 U/ml，比未優(yōu)化前提高289%。初步對酶學性質研究表明該酶的pH作用范圍為3～6，并且在90℃處理后，仍然可以保持75%的活性，具有一定的耐熱性。

酶液經過超濾濃縮損失率小于10%，加入復合穩(wěn)定劑投入飼料加工后酶活存留率大于60%，保存2個月仍有50%以上，投入到草魚養(yǎng)殖實際的應用中，得到結果當添加比率為0.08%時基本可以完全替代磷酸二氫鈣，說明本實驗室畢赤酵母工程菌具有大規(guī)模生產應用的前景。

[1]Sreekrishna K,Brankamp R G,Kropp K E,et al.Strategies for optimal synthesis and secretion of heterologous proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Gene,1997,190(1):55-62.

[2]Hong F,Meinander N Q,Jonsson L J.Fermentation strategies for improved heterologous expression of laccase in Pichia pastoris[J].Biotechnology and Bioengineering,2002,79(4):438-449.

[3]Romanos M.Advances in the use of Pichia pastoris for high-level gene expression[J].Current Opinion in Biotechnology,1995,6(5):527-533.

[4]灑榮波,石貴陽,王正祥.基因工程菌Pichia pastoris高密度培養(yǎng)條件的搖瓶研究[J].食品研究與開發(fā),2005,26(2):52-56.

[5]全國飼料工業(yè)標準化技術委員會.GB/T18634-2002[S].中華人民共和國國家標準.

[6]劉志偉,黃玉亭,張鐵鷹,等.國標法測定植酸酶活性存在問題的探討[J].中國飼料,2006（18）:29-31.

[7]竇燁,王清路,李俏俏.畢赤酵母工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2008(6):168-171.

[8]金虎,肖杰,段生兵,等.畢赤酵母流加培養(yǎng)誘導生產植酸酶的流加控制策略[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(10):9-16.

[9]李洪釗,李亮助,孫強明,等.巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)優(yōu)化策略[J].微生物學報,2003,43(2).

[10]謝子文,王紅寧.畢赤酵母工程菌產植酸酶補料分批發(fā)酵研究[J].中國釀造,2007(6):9-13.

[11]付石軍,孫建義.改善植酸酶熱穩(wěn)定性的策略[J].中國飼料,2007（14）:26-28.

[12]劉梅英,彭健,劉敏躍,等.從后處理工藝提高植酸酶熱穩(wěn)定性的研究進展[J].飼料工業(yè),2007,28(11):1-3.