枯草芽孢桿菌對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰生長(zhǎng)性能及消化酶活力的影響

仇 明 封功能 齊志濤 許 偉 楊文平 董學(xué)興 王愛(ài)民

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，放養(yǎng)密度加大，養(yǎng)殖水體環(huán)境惡化日益加劇，生態(tài)環(huán)境遭到破壞，病毒性和細(xì)菌性疾病頻繁暴發(fā)，化學(xué)藥物和抗生素的連續(xù)使用，嚴(yán)重危害著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。微生態(tài)制劑可調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境，避免了病原菌耐藥性的產(chǎn)生和藥物殘留，并在促生長(zhǎng)和提高動(dòng)物免疫力方面有良好效果，可望成為新型綠色、環(huán)保飼料添加劑。其中，芽孢桿菌(Bacillus)是一類(lèi)好氧或兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，能在動(dòng)物腸道內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，分泌產(chǎn)生多種酶類(lèi)(如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等)及營(yíng)養(yǎng)代謝產(chǎn)物(如多種氨基酸和維生素類(lèi)物質(zhì)等)，并具有抗菌性能好、良好的穩(wěn)定性及對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的益生作用和改善水產(chǎn)品質(zhì)等特點(diǎn)[3]。芽孢桿菌(Bacillus)在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用已有很多報(bào)道，但是對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)的影響研究還較少。本試驗(yàn)通過(guò)在飼料中添加枯草芽孢桿菌，分析其對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰生長(zhǎng)性能和內(nèi)源消化酶活力的影響，為進(jìn)一步研究枯草芽孢桿菌作為水產(chǎn)飼料添加劑的作用機(jī)理提供參考依據(jù)，以便更好地使用微生態(tài)制劑，并為實(shí)際生產(chǎn)人工全價(jià)飼料及投喂提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚(yú)及枯草芽孢桿菌

試驗(yàn)用魚(yú)為斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種，均重（10.48±0.21）g，購(gòu)自江蘇省泰興市水產(chǎn)良種場(chǎng)。試驗(yàn)用枯草芽孢桿菌，活菌量為5.0×109cfu/g，由無(wú)錫市大江中盛飼料有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)飼料

按照斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種營(yíng)養(yǎng)需求設(shè)計(jì)飼料配方，自制試驗(yàn)飼料。在基礎(chǔ)料 (見(jiàn)表1)中分別添加0、100、300、500和700mg/kg枯草芽孢桿菌。將各種原料分別粉碎過(guò)60目篩，精確稱(chēng)量，逐級(jí)稀釋、混合，加水?dāng)嚢杈鶆颍眯⌒惋暳现屏C(jī)制粒，直徑為2.5 mm，自然晾干，放入-20℃冰柜中冷藏備用。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共5個(gè)處理(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組)，分別對(duì)應(yīng)含枯草芽孢桿菌 0、100、300、500和700mg/kg試驗(yàn)飼料，其中Ⅰ為對(duì)照組。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚(yú)。

試驗(yàn)在鹽城工學(xué)院海洋技術(shù)循環(huán)流水養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。用3%的食鹽水溶液對(duì)試驗(yàn)魚(yú)消毒后，飼喂基礎(chǔ)飼料馴化14 d，選擇體重10.48 g左右健康的斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種450尾，隨機(jī)分組，放入到水族箱(規(guī)格為100 cm×60 cm×80 cm)中，正式試驗(yàn)從2009年6月24日至8月12日，共飼養(yǎng)50 d。每天投喂3次，時(shí)間為6:30、13:30和18:30，以魚(yú)體重的2%～4%投喂。具體投飼量根據(jù)天氣、水質(zhì)及魚(yú)的采食情況略微調(diào)整。投飼遵循“四定”原則，每次投喂0.5 h后觀察攝食情況，使其飽食而盡量不剩飼料，如有剩余餌料及時(shí)吸出。采用微流水系統(tǒng)養(yǎng)魚(yú)，24 h增氧，試驗(yàn)用水為曝氣后的自來(lái)水，平均水溫（25±2）℃，溶解氧大于 5mg/l，氨態(tài)氮低于0.4mg/l，pH值6.8～8.0，早晚各吸污1次，保證水質(zhì)符合漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 樣品收集和分析方法

1.4.1 取樣及酶液制備

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每箱取3尾魚(yú)，隨機(jī)取樣。迅速測(cè)量體長(zhǎng)、稱(chēng)體重后，置于冰盤(pán)內(nèi)解剖，取出胃、腸道、胰臟，用預(yù)冷的去離子水(4℃)洗去內(nèi)容物，剔除脂肪、腸系膜，用濾紙吸干后稱(chēng)重，然后分別加入10倍于相應(yīng)重量的預(yù)冷的0.02 mol/l、pH值7.5磷酸緩沖液，測(cè)定胃蛋白酶活力時(shí)用pH值4.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，冰浴勻漿，冷凍離心15 min(4 000 r/min)，取上清液即為酶的粗提液，置4℃下保存待用。

1.4.2 斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種生產(chǎn)性能測(cè)定及計(jì)算增重率(%)=(平均末重-平均初重)/平均初重×100；蛋白質(zhì)效率比=增重/(攝食量×飼料蛋白質(zhì)含量)。

1.4.3 消化酶測(cè)定方法

采用福林-酚試劑法測(cè)定蛋白酶活力，蛋白酶活力單位[μg/(g·min)]定義為1 g組織在30℃、pH值7.0的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個(gè)蛋白酶活力單位。采用淀粉酶檢測(cè)試劑盒(南京建成)測(cè)定淀粉酶活力，淀粉酶活性單位(U)定義為1 g組織在30℃、pH值7.0的條件下，每分鐘水解1mg的淀粉為1個(gè)淀粉酶活力單位。采用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法測(cè)定脂肪酶活性，脂肪酶活性單位[μg/(g·min)]定義為 30 ℃、pH 值 7.0的條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μg分子脂肪酸的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS8.0進(jìn)行單因素方差分析 (One-Way Anovy)，LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（±S.E.）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種生產(chǎn)性能的影響（見(jiàn)表2）

表2 枯草芽孢桿菌對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的增重率和蛋白質(zhì)效率比的影響

由表2得知，隨著枯草芽孢桿菌的添加量的增加，斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種平均末體重、平均增重率、蛋白質(zhì)效率比呈先升高后略微降低的相同變化趨勢(shì)。試驗(yàn)組平均末均重比對(duì)照組分別增重了4.23%、8.54%、10.55%、9.18%，除試驗(yàn)Ⅱ組外，其它試驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)；試驗(yàn)Ⅳ組增重的幅度最大，增重率比對(duì)照組顯著提高了46.29%(P＜0.05)；試驗(yàn)組蛋白質(zhì)效率比分別比對(duì)照組提高了14.42%、24.04%、35.58%、27.88%。

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種蛋白酶活力的影響（見(jiàn)表3）

表3 枯草芽孢桿菌對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種蛋白酶活力的影響

由表3可知，隨著飼料中枯草芽孢桿菌添加量的增加，斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種的腸道、胃、胰臟中蛋白酶活力都呈先不同程度的提高后呈著性降低的相似變化趨勢(shì)(P＜0.05)。其中，試驗(yàn)Ⅱ組的腸道、胃、胰臟中蛋白酶活力比對(duì)照組有所增加，但差異都不顯著(P＞0.05)，而試驗(yàn)Ⅲ組的斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種腸道中的蛋白酶活力比對(duì)照組提高了65.39%，試驗(yàn)Ⅳ組胃、胰臟中蛋白酶活力分別比對(duì)照組提高了37.51%、177.68%，差異顯著(P＜0.05)。說(shuō)明了飼料中添加枯草芽孢桿菌能提高斑點(diǎn)叉尾鮰消化道中蛋白酶活性，且添加量適宜時(shí)，腸道和胰臟中的蛋白酶活力提高幅度較大。

2.3 枯草芽孢桿菌對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種淀粉酶活力的影響（見(jiàn)表4）

表4 枯草芽孢桿菌對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種淀粉酶活力的影響

由表4可知，隨著飼料中枯草芽孢桿菌添加量的增加，斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種腸道中淀粉酶活力呈先提高后略有下降，再顯著性增加(P＜0.05）的曲線變化趨勢(shì)，其中試驗(yàn)Ⅴ組增加的幅度最大，比對(duì)照組提高了30.51%；胰臟中淀粉酶活力略有下降后呈顯著性增加(P＜0.05），試驗(yàn)組Ⅴ增加的幅度最大，比對(duì)照組提高了42.86%。說(shuō)明了飼料中添加枯草芽孢桿菌能提高斑點(diǎn)叉尾鮰腸道和胰臟中淀粉酶活力，增強(qiáng)對(duì)飼料中糖類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

2.4 枯草芽孢桿菌對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種脂肪酶活力的影響（見(jiàn)表5）

由表5可知，隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加，腸道中脂肪酶活力呈先提高后降低的變化趨勢(shì)，其中試驗(yàn)Ⅲ組最高，比對(duì)照組增加了61.04%。試驗(yàn)Ⅳ組胃脂肪酶活力最高，比對(duì)照組增加了43.33%，達(dá)到顯著性增加(P＜0.05）。試驗(yàn)Ⅳ組胰臟中脂肪酶活力最高，比對(duì)照組增加了48.47%。說(shuō)明了飼料中添加枯草芽孢桿菌能提高消化道中脂肪酶活力，促進(jìn)魚(yú)類(lèi)對(duì)飼料中脂類(lèi)物質(zhì)的消化吸收。

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種生長(zhǎng)性能的影響

付天璽研究發(fā)現(xiàn)，添加1.0×1011和3.0×1011cfu/kg凝結(jié)芽孢桿菌飼料組奧尼羅非魚(yú)的增重率和蛋白質(zhì)效率較對(duì)照組有顯著的提高[4]。華雪銘等研究表明，用0.2%芽孢桿菌能最有效地提高彭澤鯽對(duì)飼料蛋白的利用[5]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加100～700mg/kg枯草芽孢桿菌后飼料中蛋白質(zhì)效率比提高了14.42%～35.58%，促進(jìn)斑點(diǎn)叉尾魚(yú)鮰魚(yú)種生長(zhǎng)，體重增加4.23%～10.55%，增重率提高24.69%～46.29%，節(jié)約飼料，提高養(yǎng)殖效益。本研究還發(fā)現(xiàn)，并不是添加枯草芽孢桿量越多越好。推測(cè)可能原因是在正常情況下，水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物種群及其數(shù)量處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的微生態(tài)平衡，飼料添加芽孢桿菌量過(guò)少，不能形成優(yōu)勢(shì)種群，即達(dá)不到添加的效果；過(guò)多，則會(huì)破壞這種平衡，導(dǎo)致腸道內(nèi)菌群比例失調(diào)，生產(chǎn)性能下降。

3.2 枯草芽孢桿菌對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種消化酶活性的影響

自Sogarrd等[6]報(bào)道芽孢桿菌(Bacillus subtilis)具有消化酶活性以來(lái)，國(guó)內(nèi)在20世紀(jì)末開(kāi)始研究微生態(tài)制劑對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物消化酶活性的影響。如丁賢、潘康成、Pan、劉小剛等研究了芽孢桿菌及其它微生態(tài)制劑能提高凡納濱對(duì)蝦、鯉魚(yú)、銀鯽的消化酶活力[7-10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種飼料中添加300～500mg/kg枯草芽孢桿菌能提高消化道中蛋白酶、脂肪酶的活力;添加500～700mg/kg枯草芽孢桿菌能提高消化道中淀粉酶活力。說(shuō)明飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌能夠提高魚(yú)類(lèi)消化酶活力。

目前，有關(guān)消化酶活力高低與魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)之間的關(guān)系尚無(wú)定論。伍莉等研究認(rèn)為，斑點(diǎn)叉尾鮰消化道蛋白酶、淀粉酶的活力大小與魚(yú)的生長(zhǎng)速度沒(méi)有某種線性關(guān)系，即消化酶活力越大，生長(zhǎng)速度并不一定越快[11]。而丁賢研究表明，對(duì)蝦生長(zhǎng)與消化酶活力之間存在一定的正向作用關(guān)系，即生長(zhǎng)速度隨著酶活的增加而增大的關(guān)系[7]。本試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，飼料中添加枯草芽孢桿菌能提高消化酶活力，顯著提高蛋白質(zhì)效率、特定生長(zhǎng)率，促進(jìn)魚(yú)的生長(zhǎng)，降低餌料系數(shù)。

分析芽孢桿菌促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng)的原因，一方面是由于微生態(tài)制劑在宿主消化道內(nèi)定植、繁衍、代謝后，可以產(chǎn)生一些消化酶活性物質(zhì)。已有研究表明，動(dòng)物攝食了添加芽孢桿菌的飼料后，腸道內(nèi)能產(chǎn)生多種酶，如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、果膠酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶等，補(bǔ)充了內(nèi)源酶的不足，提高了消化道酶的活性，從而促進(jìn)機(jī)體消化系統(tǒng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的消化和吸收，提高消化效率[12-13]。但具體是益生菌刺激了腸道消化酶的分泌，還是由于所添加的益生菌本身所產(chǎn)生的胞外酶起作用或是這兩種情況共同作用，還有待進(jìn)一步探討。另一方面，枯草芽孢桿菌在其生長(zhǎng)、繁殖過(guò)程中，又能自身合成VC、VB1、VB2和VB6以及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)其生長(zhǎng)，提高生產(chǎn)性能[14]。

[1]吳皓,吳盛輝.微生態(tài)制劑及其在魚(yú)病防治中的應(yīng)用 [J].水利漁業(yè),2008,28(1)14-16.

[2]劉燕,王靜慧.微生態(tài)理論和我國(guó)動(dòng)物微生態(tài)制劑研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)獸藥雜志,2002,36(8):35-38.

[3]Inooka S,Kimura M.The effect of Bacillus natto in feed on the sheep red blood cell antibody response in chickens[J].Avian Dis.,1983,(27):1086-1089.

[4]付天璽,許國(guó)煥,吳月嫦,等.凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)奧尼羅非魚(yú)消化酶活性、消化率及生長(zhǎng)性能的影響 [J].淡水漁業(yè),2008,38(4):30-35.

[5]華雪銘,周洪琪.芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽飼料蛋白質(zhì)利用的影響[J].飼料研究,2008(1):57-58.

[6]Sogarrd D H,Denmark A S.Microbials for feed beyond lactic acid bacterial[J].Feed Inter.,1990,11(4):32-37.

[7]丁賢,李卓佳,陳永青,等.芽孢桿菌對(duì)凡納對(duì)蝦生長(zhǎng)和消化酶活性的影響[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2004,11(6):580-584.

[8]潘康成,何明清,劉克琳.微生物添加劑對(duì)鯉魚(yú)生長(zhǎng)和消化酶活性的影響研究[J].飼料工業(yè),1997,18(10):41-42.

[9]Pan K C,Yang H B.Progress in study of machanism of Bacillus[J].Feed Industry,1997,28(9):32-34.

[10]劉小剛,周洪琪,邱小琮,等.微生態(tài)制劑對(duì)異育銀鯽消化酶活性的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2002,26(5):448-452.

[11]伍莉,陳鵬飛,羅紹祿,等.不同添加劑對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰腸道蛋白酶、淀粉酶活力的影響[J].飼料研究,2002(1)：4-7.

[12]劉波,謝駿,劉文斌,等.地衣芽孢桿菌與低聚木糖對(duì)異育銀鯽消化酶活性、腸道菌群及生長(zhǎng)的影響 [J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,21(4):336-340.

[13]Ghosh K,Sen S K,Ray A K,et al.Characterization of bacillus isolated from the gut of rohu,Labeo rohita,fingerlings and its significance in digestion [J].Journal of Applied Aquaculture,2002,12(3):33-42.

[14]杜衛(wèi)萍.多粘芽孢桿菌分解飼料蛋白和促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng)的研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.