葡萄糖氧化酶基因轉化玉米及其后代的抗病性研究

劉昭軍，邸 宏，李 鐵，成 瑜，趙 曦，劉麗艷，王永斌，趙遠玲，王廣金，王振華

（1.黑龍江省作物與家畜分子育種重點實驗室，哈爾濱 150086；2.黑龍江省農業科學院生物技術研究所，哈爾濱 150086；3.東北農業大學農學院，哈爾濱 150030）

玉米（Zea mays L.）是黑龍江省重要的糧食作物，隨著種植面積的不斷擴大，由于多年連作以及致病菌生理小種的不斷進化，玉米病害越來越嚴重，直接影響玉米的生產。目前防治玉米病害的方法主要有化學防治、生物防治以及農業防治等等。隨著基因工程技術在農作物育種上的廣泛應用，培育了許多抗病蟲轉基因農作物品種，大大減輕了化學防病的環境危害并且防效顯著。國外轉基因玉米的研制開展較早，應用效果良好，目前已經有近百個抗除草劑、抗蟲轉基因玉米品種在生產上應用。我國玉米轉化研究起步較晚，成功的報道不多[1-4]。

隨著基因轉化技術的深入和成熟，許多玉米轉化方法得以研發，如農桿菌感染法[5-7]、基因槍法[2]、原生質體PEG介導法[8]、顯微注射法[1]等均成功獲得了轉化植株。花粉管通道法是利用外源DNA涂抹柱頭，滴入柱頭切口或與受體植物自身的花粉混合，使外源DNA隨著授粉受精過程沿花粉管滲入，經珠心通道進入胚囊，轉化尚不具備細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞。該方法具有操作簡便、無基因型選擇、外源基因純合穩定所需時間短等優點，可與常規育種工作結合進行[9-10]。植物在受到病原微生物侵染以后，往往產生一系列防御反應，細胞內活性氧（Active oxygen species，AOS），包括過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（·OH）和超氧化物陰離子（O2-）等受誘導釋放。其中過氧化氫不僅對病原微生物有直接的抑殺作用，而且和相關的AOS一起被認為在對植物的超敏反應和系統獲得性反應中起十分重要的作用。葡萄糖氧化酶基因（Glucose oxidase，GO）它可以催化 β-D-葡萄糖氧化生成過氧化氫和葡萄糖酸[11-12]，因此我們希望在玉米中表達GO基因，通過H2O2的產生來誘導植物的防御反應以提高植物的抗病性。本研究采用花粉管通道法，用葡萄糖氧化酶基因轉化玉米，目的是獲得抗玉米大斑病的植株，同時優化轉化影響因子，建立高效、易重復的玉米遺傳轉化系統，拓寬玉米抗病基因資源，為玉米基因工程提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗共用4份玉米自交系：其中抗大斑病自交系1份（05-830）、感大斑病自交系3份（543、05-848、03-812），均由黑龍江省農業科學院玉米研究所提供。試驗用雙元質粒載體pGBIGO含有人工合成的葡萄糖氧化酶基因（GO）、NPTⅡ基因，這兩個基因分別帶有胭脂堿合成酶的NOS啟動子和花椰菜花葉病毒的35S啟動子（見圖1）。

圖1 pGBIGO質粒Fig.1 pGBIGO plasmid

1.2 方法

1.2.1 質粒DNA提取

采用堿裂解法[13]，提取后在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，分析其純度和濃度。

1.2.2 導入基本操作方法

在玉米剛剛要抽出花絲的時候，將雌穗套袋，待花絲抽出10～15 cm時，進行人工授粉，記錄授粉時間，授粉后12～36 h剪去雌穗頂端多余的苞葉。從花絲頂端2～3 cm處剪齊，中間用手術刀將花絲去除，挖出1個由苞葉圍成的小穴，用5 mL注射器將質粒DNA溶液注入小穴，滴注大約500～1 000 μL，使花絲完全浸潤在DNA溶液中，待溶液被吸收后，重復滴注一次。記載導入時間和質粒的濃度等。操作在晴天的上午進行。轉化后1周，檢查雌穗生長情況，去除污染物，秋后按株穗為單位收獲D0代種子。

1.2.3 不同濃度DNA溶液對結實率的影響

配制4個濃度的質粒DNA（0、50、100、200 μg·L-1），在授粉后20 h分別轉化自交系543、05-848、03-812，收獲時按不同的組合統計結實率。

1.2.4 不同濃度DNA和轉化時期對轉化效率的影響

配制3個濃度的質粒DNA（50、100、200μg·L-1）以及5個導入時間（分別為授粉后5、10、15、20和25 h），分別轉化自交系543、05-848、03-812，共27個處理，每個處理操作10個雌穗。收獲的轉化籽粒用400 mg·L-1的卡那霉素溶液浸泡24 h后分批分次播種于溫室花盆中[14]。出苗后每隔一周用400 mg·L-1的卡那霉素水溶液進行噴澆，可看到一部分苗出現白化現象。計算轉化率（%）=D0代卡那霉素抗性株數/總株數×100%。

1.2.5 轉基因植株的檢測

卡那霉素檢測：轉化D0籽粒用400 mg·mL-1的卡那霉素溶液浸泡20 h后種植，卡那霉素抗性正常苗在3葉期繼續涂抹卡那霉素溶液，抗性植株無變色反應，仍然持綠。初步計算轉化率。

PCR檢測：對D0代卡那霉素抗性植株用CTAB法提取的葉片總DNA作模板，以GO基因編碼區兩端的部分序列（Primer 1∶5'AGCAGTGTGGAA GGCAAGCAG 3'，Primer 2∶5'CTGACCTTGTCACCT CTCAG 3'）為引物，反應體系為94℃預變性，2 min，94℃變性，10 s，60℃退火，30 s，70℃延伸1 min，30次循環，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。計算轉化率。

1.2.6 大斑病抗性測定

接種方法：將上年秋季采集的玉米大斑病病葉粉碎浸泡24 h，選擇空氣濕度較大的傍晚將濕碎葉撒在玉米心葉內，接菌2次，人工接菌在玉米拔節后和抽雄前期進行。

病情調查分級標準參照孫海潮等的玉米大斑病鑒定標準進行田間調查[8]。1級：全株葉片無病斑或僅在穗位下部葉片上有零星病斑，病斑占葉面積少于5%；3級：穗位下部葉片上有少量病斑，占總面積的6%～10%，穗位上部葉片有零星病斑；5級：穗位下部葉片上病斑較多，占總面積的11%～30%，穗位上部葉片有少量病斑；7級：穗位下部葉片或穗位上部葉片有大量病斑，病斑相連，占總面積的31%～70%；9級：全株葉片基本為病斑覆蓋，葉片枯死。其中，1級為高抗（HR），3級為抗病（R），5級為中抗（MR），7級為感病（S），9級為高感（HS）。

以抗病自交系05-830為抗病絕對對照，未轉化自交系植株作相對對照，進行轉化植株葉片病斑數據統計，進行大斑病抗性分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度DNA溶液對結實率的影響

如表1所示，隨著DNA濃度加大，雌穗結實率呈下降趨勢，從32.1粒·穗-1（DNA濃度為0 μg·mL-1）下降到10.8粒·穗-1（DNA濃度為200 μg·mL-1）。很多穗或籽粒由于DNA的導入發育不良或發霉無法收獲，僅收獲了近50%的穗數。因此，應采取一定的對策來提高結實率。在導入轉化1周后，檢查雌穗發育狀況，及時去除發育停滯的雌穗；盡量在保證轉化的前提下，減少導入DNA溶液的體積；另外轉化操作盡量在上午濕度在85%以上的晴朗天氣進行，防止DNA溶液蒸發過快。

表1 不同自交系及DNA濃度對結實率的影響Table 1 Effect of different inbred lines and DNA concentration on seed-set

2.2 DNA濃度與轉化時期對轉化效率的影響

DNA濃度大小影響DNA的運輸速度，授粉時間長則花粉管通道已經閉合、授粉時間短則花粉管通道尚未形成，均影響DNA到達胚性細胞，進而影響轉化。由表2可以看出，授粉后10 h外緣DNA就可以整合到受體基因組，但轉化頻率較低（0.04%），授粉后15 h獲得了最高的轉化率（1.17%），在以后的時間內轉化率逐漸下降，對所設置的處理研究發現，花粉管通道法介導轉化玉米，基因型間轉化率無差異，最適合的轉化DNA濃度為100 μg·mL-1。在授粉后15 h轉化率最高，隨后轉化率逐漸下降。本試驗優化的轉化條件為人工自交授粉后15 h為最佳導入時間，所用DNA濃度為 100 μg·mL-1。

表2 DNA濃度和轉化時期對轉化率的影響Table 2 Effect of DNA concentration and transformation duration on transformation frequency

2.3 轉化體的卡那霉素抗性檢測

三種自交系共轉化雌穗200個，獲得3 276個籽粒，將這些用卡那霉素溶液（400 mg·L-1）浸種后出苗2 043株，其中白化株為1 013株，三葉期通過卡那霉素涂抹進行抗性篩選，獲得244個D0代卡那霉素抗性植株（包括1/2葉片持綠株）。

2.4 PCR檢測結果

PCR方法可以方便地從大量的后代植株中篩選出少數的目標轉化植株，使篩選簡便、快捷、經濟。將初步卡那霉素抗性篩選陽性的D0代提取葉片總DNA，對其進行PCR檢測。本試驗設計了一套簡化的復合分組篩選策略，簡化玉米葉片模板DNA分離方法，提取時間縮短至5 min。具體的篩選策略為：以組合為單位，從D0代的幼嫩轉基因植株上取半片小葉，分別提取總DNA后，以10株為1個單位混合總DNA進行PCR擴增，發現陽性擴增片斷后，再分別檢測該組合內的10個植株，使檢測效率提高了10倍以上。如圖2所示，本試驗結果獲得13株PCR陽性植株。其中5株543、4株05-848和4株03-812。

圖2 D0代玉米植株的PCR檢測Fig.2 PCR analysis of maize D0plants

2.5 轉化植株的抗病性篩選

根據孫海潮報道的抗病性篩選方法[8]，統計了13個PCR陽性植株在田間自然發病情況下的玉米大斑病抗病性情況，結果見表3。4個植株抗病性未增強（D3、D7、D10、D13），6個植株抗病性有所改善，其中3株（D2、D4、D8）為高抗。選擇抗病性穩定植株需要在基本抗病株自交后代中繼續接種鑒定進行，這部分工作正在進行中。

表3 PCR陽性植株的田間抗病性鑒定Table 3 Disease resistance certification of PCR-positive plants in field

3 討論與結論

由于抗病材料和抗性遺傳研究缺乏，限制了玉米抗病育種技術的發展。本研究所用抗病對照05-830雖然大斑病抗性較好，但籽粒小、多分蘗，通過常規育種改造困難。本研究通過轉基因技術轉化一般配合力較好、抗病性差的自交系，提高抗病性，為培育實用抗病玉米自交系提供了一個新途徑。本研究中卡那霉素抗性篩選與PCR的檢測存在一定的差異，主要原因是花粉管通道轉化方法在一定程度上影響了玉米轉化籽粒發育，因此D0代植株生長及基因表達存在差異，因而卡那霉素抗性表達存在差異。在進行D0代植株的卡那霉素抗性篩選時應采用相對較低的濃度。在檢測的過程中，由于轉化籽粒多，本研究則根據田間植株的生長差異結合卡那霉素抗性篩選的結果進行分子檢測，在一定程度上，既減少了工作量，又防止了轉化基因植株漏檢。另外，本試驗采用復合分組PCR的檢測方法在很大程度上減少了工作量，作者認為該方法非常適用于花粉管通道法轉化后代的檢測。

花粉管通道法轉化外源總DNA技術己經在棉花、水稻、大豆、小麥及玉米等多種作物中獲得了成功[17-21]。與農桿菌介導法、基因槍法等轉化方法相比，花粉管通道法轉化省去了其他轉化方法的組織培養過程，具有簡便、效率高和可操作性強等特點。本研究將該方法用于轉化葡萄糖氧化酶抗病基因，取得了理想的效果。花粉管通道法轉化關鍵是確定適宜的導入時間，利于外源DNA的進入和整合。導入充分考慮溫度、濕度等氣象因子，同時結合不同受體材料的受精發育特點，本試驗確定授粉后15～20 h為最佳導入時間段。本試驗用該方法轉化，通過檢測，部分轉化后代提高了大斑病抗性，為玉米抗病育種提供了一個新途徑。

*邸宏為本文的同等貢獻者。

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