川芎嗪對(duì)熱應(yīng)激所致豬睪丸細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

張曉峰,劉 迪,李 垚

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150081)

由于畜禽飼養(yǎng)密度相對(duì)過(guò)大,使飼養(yǎng)環(huán)境溫度升高,由此導(dǎo)致的動(dòng)物熱應(yīng)激(heat stress)給養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。熱應(yīng)激對(duì)動(dòng)物繁殖性能的負(fù)面影響引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,但熱應(yīng)激對(duì)畜禽繁殖性能不良影響的機(jī)理尚不十分清楚。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是從川芎的干燥根莖中提取的一種生物堿單體,其化學(xué)結(jié)構(gòu)為4-甲基吡嗪,具有抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、保護(hù)血管內(nèi)皮、改善微循環(huán)等多種藥理作用,用于部分心腦血管等疾病的治療并取得良好療效[1];TMP同時(shí)還具有抗氧化、抑制和清除自由基產(chǎn)生、提高內(nèi)源性超氧化物歧化酶活性等生物作用,但其作用機(jī)制尚未闡明[2]。正常生理情況下,體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),當(dāng)動(dòng)物受到應(yīng)激時(shí),會(huì)使自由基產(chǎn)生增加,而自由基清除體系能力不足,造成體內(nèi)自由基蓄積,導(dǎo)致組織氧化損傷。本研究以豬睪丸細(xì)胞為研究對(duì)象,以活性氧(reactive oxygen species,ROS)為著眼點(diǎn),探討TMP對(duì)熱應(yīng)激所致細(xì)胞氧化損傷的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 川芎嗪購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司,純度98%,白色針狀結(jié)晶,溶于60°C熱水中;MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;小牛血清購(gòu)自上海緯群生物技術(shù)有限公司;EDTA/胰酶和MT T購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;流式細(xì)胞儀(Beckman,美國(guó));電熱鼓風(fēng)干燥箱(泰斯特,中國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 豬睪丸(ST)細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所王永博士惠贈(zèng)。細(xì)胞在37°C、5%CO2條件下培養(yǎng)于含 10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基中,EDTA/胰酶消化、傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組與處理 試驗(yàn)設(shè)熱應(yīng)激組、TMP組、熱應(yīng)激+TMP組、陰性對(duì)照組。熱應(yīng)激組細(xì)胞置于電熱干燥箱中43°C恒溫烘烤;熱應(yīng)激+TMP組細(xì)胞先加入TMP預(yù)培養(yǎng)12 h后,再43°C恒溫烘烤;TMP組細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)束前12 h加入TMP;陰性對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理。

1.4 細(xì)胞毒性檢測(cè)(MT T分析法) 將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(1×104/孔),培養(yǎng)24 h后按上述方法處理細(xì)胞,另設(shè)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,每組6個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MT T(5 mg/mL,20μL/孔),培養(yǎng)結(jié)束后棄去液體 ,加入DMSO(150μL/孔)震蕩混勻,于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(OD)值,計(jì)算抑制率。

1.5 細(xì)胞活性氧檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。2×104細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,按上述方法處理細(xì)胞后,采用原位裝載探針的方法,加入DCFH-DA(終濃度 3.3 μ mol/L)37°C 孵育 20 min,用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,收集細(xì)胞懸浮于PBS中流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 熱應(yīng)激及TMP細(xì)胞毒性作用 在本試驗(yàn)條件下,熱應(yīng)激、TMP及兩者聯(lián)合作用細(xì)胞后,均未見(jiàn)明顯的細(xì)胞毒性作用,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 熱應(yīng)激及TMP對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平影響43℃作用細(xì)胞1 h,細(xì)胞內(nèi)ROS水平與對(duì)照組比較未見(jiàn)明顯升高(P＞0.05),但43℃作用2 h細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(P＜0.05)。160μg/mL和320μg/mL TMP能顯著抑制熱應(yīng)激所致細(xì)胞內(nèi) ROS水平的升高,結(jié)果見(jiàn)圖2。

3 討論

ROS是指含氧的自由基,是細(xì)胞氧化磷酸化過(guò)程氧的代謝副產(chǎn)物,是一類(lèi)有高度化學(xué)反應(yīng)活性的含氧基團(tuán),包括羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O-2·)、單線態(tài)氧(O2)及過(guò)氧化氫(H2O2)等[3]。ROS容易與生物大分子發(fā)生反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞,影響機(jī)體正常細(xì)胞和組織的功能,從而引起多種疾病。過(guò)量ROS生成時(shí)會(huì)對(duì)生殖細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用,攻擊細(xì)胞膜及脂蛋白中的多元不飽和脂肪酸,導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性下降和脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)和DNA破壞或參與誘導(dǎo)生殖細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而直接和間接影響畜禽的繁殖功能[4-5]。有研究表明,ROS與精子畸形率有極密切的關(guān)系,ROS產(chǎn)生過(guò)量過(guò)多時(shí),形態(tài)異常以及活動(dòng)性差的精子數(shù)量則會(huì)增多[6]。本研究結(jié)果表明,熱應(yīng)激作用細(xì)胞1 h,細(xì)胞內(nèi)ROS水平未發(fā)生顯著變化,但作用細(xì)胞2 h,細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高,提示熱應(yīng)激能誘發(fā)睪丸細(xì)胞內(nèi)ROS生成,進(jìn)而可能會(huì)影響睪丸細(xì)胞的生精功能。在脫離熱應(yīng)激源后,隨著時(shí)間延長(zhǎng),睪丸細(xì)胞內(nèi)ROS水平如何變化,我們將在以后的研究中進(jìn)一步探討。另外,在本研究中,我們觀察了TMP對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用,結(jié)果表明 TMP能顯著抑制熱應(yīng)激所致的細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,具有劑量-效應(yīng)關(guān)系,進(jìn)一步證明了TMP具有抗氧化、抑制自由基的作用,同時(shí)也為探尋抗熱應(yīng)激劑提供了研發(fā)方向。我們?cè)噲D檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中參與機(jī)體氧化和抗氧化反應(yīng)的酶的變化,但由于試驗(yàn)方法檢測(cè)靈敏度的限制,而沒(méi)有成功。

綜上所述,熱應(yīng)激能使睪丸細(xì)胞內(nèi)活性氧生成增加,誘發(fā)氧化損傷,川芎嗪能顯著抑制熱應(yīng)激所致的睪丸細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成,具有抗氧化損傷作用。

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