PCR與Real-time PCR方法檢測(cè)海產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌的比較

徐素惠,曾 靜,除守建,程 剛,趙立紅

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193;2.北京市出入境檢驗(yàn)檢疫局朝陽分局,北京 朝陽 100026)

創(chuàng)傷弧菌自然生存于近海和海灣的海水和海底沉積物中,其分布與海水的溫度和鹽度密切相關(guān)[1]。進(jìn)食被創(chuàng)傷弧菌污染的食物后,創(chuàng)傷弧菌能迅速通過腸黏膜侵入血液,引起原發(fā)性敗血癥。據(jù)報(bào)道美國每年有20～40個(gè)原發(fā)性創(chuàng)傷敗血癥病例,死亡率高達(dá)50%,在佛羅里達(dá)創(chuàng)傷弧菌感染是導(dǎo)致食源性死亡的主要原因[2-3]。我國近年來也有相關(guān)報(bào)道[4-5],因此加強(qiáng)對(duì)海產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的檢查對(duì)保證食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 魚、蝦、貝類等海產(chǎn)品以及創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株,均由北京市出入境檢驗(yàn)檢疫局提供。

1.2 引物 引物參照FDA細(xì)菌分析手冊(cè)擴(kuò)增vvhA基因上一段519 bp的序列 PCR引物序列上游為 :5′-ccg cgg tac agg ttg gcg ca-3′,下游為 :5′-cgc cac cca ctt tcg ggc c-3′;Real-time PCR引物序列上游為 :5′-ttc caa ctt caa acc gaa cta tga c-3′,下游為:5′-att cca gtc gat gcg aat acg ttg-3′;熒光探針:5′-FAM-aac tat cgt gca cgc ttt ggt acc gt-TAMRA-3′。

1.3 樣品處理 分別將標(biāo)準(zhǔn)菌株和經(jīng)高速勻漿處理待檢海產(chǎn)品樣本,在堿性蛋白胨水(APW)中增殖,37℃ ,16～18 h,用煮沸法提取DNA,13000 r/min離心5 min,取上清液備用。

1.4 細(xì)菌DNA的PCR擴(kuò)增 以提取的創(chuàng)傷弧菌DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:10×Buffer 2.5μL;dNTP 2μL;上 下游 引物 各 1μL;Taq 酶0.1μL;超純水 17.4μL;模板 1μL 。反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性3 min,94℃變性45 s,60℃退火45 s,72℃延伸45 s,最后72℃延伸 10 min,擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 細(xì)菌DNA的Real-time PCR擴(kuò)增 以提取的創(chuàng)傷弧菌DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:2×Taq mix 12.5μL,上下游 引物各 1μL,熒光探 針0.5μL,超純水 9μL,模板 1μL,進(jìn)行擴(kuò)增 。

1.6 靈敏度比較 取兩份過夜培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌液各1mL,分別以10-1～10-9梯度稀釋。一份采用煮沸法提取DNA,分別進(jìn)行PCR和Real-time PCR檢測(cè),以確定檢測(cè)限。另一份做相應(yīng)的菌落計(jì)數(shù)以定量,比較兩種方法的敏感度。

1.7 特異性試驗(yàn) 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株和陽性樣品,陰性樣品和超純水空白對(duì)照,以及近源菌(與創(chuàng)傷弧菌同屬不同種,如副溶血弧菌、霍亂弧菌)、遠(yuǎn)源菌(與創(chuàng)傷弧菌不同屬,如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)共60株進(jìn)行PCR和Real-time PCR反應(yīng),檢測(cè)其交叉反應(yīng)性。

1.8 待檢樣品的檢測(cè) 分別用PCR和Real-time PCR對(duì)196份待檢海產(chǎn)品樣品進(jìn)行檢查,確定其實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 靈敏度 從圖1和圖2可知,PCR的檢查限為10-4,可檢出菌落數(shù)為375 CFU/mL,Real-time PCR檢查限達(dá)10-8,可檢出菌落數(shù)為21 CFU/mL。

2.2 特異性

2.2.1 PCR反應(yīng) 從圖3可知,標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株和陽性樣品均可見約為519 bp大小的清晰電泳條帶,陰性樣品和空白對(duì)照均未見任何電泳條帶。

圖3 PCR電泳圖

2.2.2 Real-time PCR擴(kuò)增 由圖4可知,標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株的Ct=23.29,陽性樣品Ct=18.32,均呈明顯的擴(kuò)增,而陰性樣品和空白對(duì)照均未有擴(kuò)增。

2.2.3 近源菌和遠(yuǎn)源菌的特異性檢測(cè) 結(jié)果發(fā)現(xiàn)60株創(chuàng)傷弧菌的近源菌和遠(yuǎn)源菌的PCR和Realtime PCR檢測(cè)均為陰性。

2.3 兩種方法對(duì)待檢海產(chǎn)品檢查結(jié)果 對(duì)196份海產(chǎn)品樣品檢查結(jié)果顯示,PCR陽性率為10.67%,Real-time PCR陽性率為17.98%。

3 討論

隨著人民生活水平的不斷提高以及觀念意識(shí)的更新,海產(chǎn)品因其較高的營養(yǎng)價(jià)值越來越受廣大消費(fèi)者歡迎,為保持口感鮮嫩,人們喜歡食用生的或半熟的海產(chǎn)品。而海產(chǎn)品極易被創(chuàng)傷弧菌污染,食入后創(chuàng)傷弧菌能迅速通過腸黏膜侵入血液,引起原發(fā)性敗血癥。加強(qiáng)對(duì)海產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌(特別是致病性創(chuàng)傷弧菌)的檢測(cè),對(duì)有效地防止創(chuàng)傷弧菌的傳播和監(jiān)控進(jìn)出口海產(chǎn)品的質(zhì)量,確保消費(fèi)者的健康具有重要意義。

3.1 創(chuàng)傷弧菌的常規(guī)檢測(cè)方法需經(jīng)增菌、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)反應(yīng)等過程,操作繁瑣、耗時(shí)長、檢出率低,不能滿足生產(chǎn)實(shí)際需要,而分子生物學(xué)檢測(cè)方法敏感、特異。本試驗(yàn)用 PCR和 Realtime PCR分別對(duì)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)創(chuàng)傷弧菌創(chuàng)傷弧菌增菌液進(jìn)行,結(jié)果表明PCR的檢測(cè)限為10-4,菌落形成單位為375 CFU/mL,Real-time PCR的檢測(cè)限達(dá)10-8,菌落形成單位為21 CFU/mL。可見Real-time PCR對(duì)創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)靈敏度比PCR更高,更能滿足實(shí)驗(yàn)室快速、準(zhǔn)確診斷的需要。

3.2 用PCR和Real-time PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株和陽性樣品均呈陽性,陰性樣品和空白對(duì)照則未見擴(kuò)增;對(duì)近源菌和遠(yuǎn)源菌共60株的檢測(cè)也均表現(xiàn)為陰性。可見兩種方法對(duì)創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)有很好的特異性。

3.3 為避免雜菌和堿性蛋白胨水(APW)對(duì)檢測(cè)的干擾,本試驗(yàn)還將標(biāo)準(zhǔn)菌株增菌液離心,棄去上清,用 TA緩沖液重懸,重復(fù)兩次,再提取DNA,與直接用標(biāo)準(zhǔn)菌株增菌液煮沸提取DNA進(jìn)行比較,觀察堿性蛋白胨水(APW)對(duì)檢測(cè)的干擾,發(fā)現(xiàn)結(jié)果沒有差異。將標(biāo)準(zhǔn)菌株增菌液與海產(chǎn)品中經(jīng)常分離到的雜菌進(jìn)行不同濃度的混合,觀察雜菌的存在是否會(huì)影響檢出限,結(jié)果表明,不論對(duì)PCR還是Real-time PCR的檢出限均無影響。

3.4 比較196份待檢海產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),PCR檢測(cè)陽性率為10.67%,Real-time PCR陽性率為17.98%。表明 Real-time PCR比PCR靈敏度更高,更能滿足實(shí)際應(yīng)用。

綜上所述,PCR與Real-time PCR對(duì)海產(chǎn)品中的創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)均具有很好的特異性,但 Realtime PCR靈敏度更高,而且不需要瓊脂糖凝膠電泳,快速省力(2 h即可報(bào)告結(jié)果),是實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的首選方法。

另據(jù)報(bào)道,有基于 toxR基因[6]、rpoS基因[7]建立的檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的Real-time PCR,雖然基于這些基因的Real-time PCR能很好地鑒定創(chuàng)傷弧菌,但無法區(qū)別有毒無毒菌種。而基于16S rDNA基因[8]的Real-time PCR,由于其基因的緩慢進(jìn)化不適合區(qū)別弧菌的種。本試驗(yàn)所用的PCR和 Realtime PCR均基于創(chuàng)傷弧菌的毒力基因vvhA,在保證敏感性和特異性的基礎(chǔ)上可以直接檢出對(duì)人體有毒害的創(chuàng)傷弧菌,對(duì)保障海產(chǎn)品的食品衛(wèi)生更具意義。

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