豬輪狀病毒油乳劑滅活疫苗的制備及免疫原性試驗(yàn)

史月明,葛俊偉,喬薪瑗,劉力威,張冠群,李一經(jīng)

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江省獸醫(yī)研究所,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

豬輪狀病毒(porcine rotavirus)屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)、輪狀病毒屬(Rotavirus),是引起仔豬發(fā)生急性胃腸道傳染病的重要病原,自1975年Woode和Bridge首次從豬體分離出豬輪狀病毒以后,世界各國(guó)均有不同程度的豬輪狀病毒感染報(bào)道。在我國(guó)豬輪狀病毒感染亦十分普遍,李國(guó)平等在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)仔豬1～10日齡陽(yáng)性率42.4%～66%,10日齡到斷奶陽(yáng)性率83.2%～91.7%,斷奶后陽(yáng)性率為63.2%～72%[1]。臨床癥狀主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉,成年豬一般呈隱性感染。鑒于豬輪狀病毒感染普遍,危害大,對(duì)豬進(jìn)行疫苗接種預(yù)防豬輪狀病毒感染具有重要意義。本試驗(yàn)旨在制備豬輪狀病毒油乳劑滅活疫苗,并研究其免疫原性,為該疫苗的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒種、細(xì)胞和試驗(yàn)動(dòng)物 豬輪狀病毒系國(guó)內(nèi)分離株JL94株細(xì)胞適應(yīng)毒[2];MA-104細(xì)胞自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;家兔體重約2.5 kg,購(gòu)自哈藥集團(tuán)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 檢測(cè)抗原、抗體和主要試劑 重組豬輪狀病毒VP6抗原,抗豬輪狀病毒VP6蛋白單抗由本實(shí)驗(yàn)室制備保存[3-4];滅活劑BEI購(gòu)自Alfa-Aesar公司;10號(hào)白礦油購(gòu)自杭州煉油廠;司盤-80購(gòu)自上海大眾制藥廠。

1.3 毒種的研究

1.3.1 原始毒種的鑒定 將豬輪狀病毒JL94株細(xì)胞培養(yǎng)物接種MA-104細(xì)胞,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。將收獲的病毒純化后[5]通過(guò)電鏡觀察、RT-PCR[3]及測(cè)序進(jìn)行鑒定。

1.3.2 種子批的建立 基礎(chǔ)種毒的建立:取本實(shí)驗(yàn)室保存的原始種毒進(jìn)行傳代,每隔4代進(jìn)行TCID50測(cè)定,當(dāng)細(xì)胞毒價(jià)穩(wěn)定在106.5～107.5TCID50/0.2mL,混勻后分裝,保存于-86℃,制成基礎(chǔ)種毒。

生產(chǎn)種毒建立:取基礎(chǔ)種毒,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),混合后分裝,保存于-86℃,制備成生產(chǎn)種毒,用于制備疫苗。

1.3.3 毒種的細(xì)菌和支原體檢測(cè) 按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行檢測(cè)[6]。

1.4 制備疫苗 滅活:生產(chǎn)種毒按終濃度1.5%加入BEI,37℃滅活24 h,加入2%硫代硫酸鈉終止滅活。滅活后抗原原液、十倍和百倍稀釋液接種MA-104細(xì)胞培養(yǎng)120 h,觀察細(xì)胞病變。

油相制備:取10號(hào)白油,加入硬脂酸鋁使其濃度達(dá)到2%,邊加邊攪拌,加熱直至硬脂酸鋁全部溶解為止。然后加入司盤-80,使其終濃度達(dá)到6%,攪勻后停止加熱。

水相制備:將滅菌吐溫-80加入到滅活病毒懸液中,使其終濃度達(dá)到4%～5%,充分?jǐn)噭?直到吐溫-80徹底溶解。

乳化:取油相放入膠體磨中慢速攪拌,同時(shí)徐徐加入水相,使油相與水相體積比為1.5∶1,8000～10000 r/min乳化10 min。終止攪拌前加入1%硫柳汞,使其終濃度為0.01%。

1.5 疫苗物理性狀測(cè)定 冷水表面試驗(yàn):將疫苗數(shù)滴滴于冷水表面,觀察是否擴(kuò)散;黏度檢測(cè):室溫用1mL吸管吸取疫苗1mL,使其自由落下,記錄滴下0.4mL疫苗所需時(shí)間;穩(wěn)定性試驗(yàn):將疫苗3000 r/min離心15 min,分別置37℃和4℃冰箱觀察分層情況。

1.6 家兔免疫 將家兔隨機(jī)分為2組,命名為首免組和二免組。各組均肌肉注射豬RV滅活油佐劑疫苗免疫1.5mL/只;2周后二免組進(jìn)行同劑量同批次疫苗加強(qiáng)免疫,免疫前各組采血1次及免疫后每周采血分離血清,分裝后-86℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 血清中豬RV特異性抗體水平檢測(cè) 采用間接ELISA[7]和細(xì)胞中和試驗(yàn)[8]進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 原始種毒鑒定結(jié)果

2.1.1 電鏡檢查結(jié)果 純化后病毒經(jīng)電鏡觀察,病毒顆粒略呈圓形,直徑為65 nm～75 nm,形似車輪,為典型的輪狀病毒顆粒。見(jiàn)圖1。

2.1.2 RT-PCR鑒定結(jié)果 VP6全基因長(zhǎng)1356 bp,擴(kuò)增產(chǎn)物約為1300 bp,與預(yù)期結(jié)果相一致,見(jiàn)圖2。并將擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)序列測(cè)定與GenBank中JL94株VP6序列(AY538664)比對(duì),相似度100%。

2.2 種子批毒種的建立 基礎(chǔ)種毒的建立:將原始毒種JL94株進(jìn)行培養(yǎng),增殖到第58代,收獲的毒價(jià)穩(wěn)定在108.25TCID50/mL,見(jiàn)表1。將病毒按每包裝5mL,-86℃凍存,建立基礎(chǔ)毒種批。

圖2 PRV JL94株VP6基因的RT-PCR結(jié)果

生產(chǎn)種毒的建立:將基礎(chǔ)種子批病毒第58代進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),按每包裝400mL,-86℃凍存,建立工作毒種庫(kù)。

表1 病毒TCID50的測(cè)定

2.3 毒種的細(xì)菌、支原體檢測(cè)結(jié)果 毒種豬RV JL94株經(jīng)檢驗(yàn),均無(wú)需氧菌、厭氧菌、真菌和支原體污染。

2.4 疫苗的制備結(jié)果

2.4.1 抗原液滅活檢測(cè) 將BEI滅活抗原液的原液、10倍稀釋液與100倍稀釋液接種于MA-104細(xì)胞后120 h均無(wú)CPE出現(xiàn),該抗原液滅活徹底。

2.4.2 疫苗物理性狀測(cè)定 冷水表面試驗(yàn):疫苗滴于冷水表面,油滴邊緣整齊,不向四周擴(kuò)散,說(shuō)明疫苗是穩(wěn)定的油包水型;黏度檢測(cè):1mL吸管吸取1mL疫苗室溫垂直滴下所需時(shí)間為7～8 s,在規(guī)定的黏度范圍內(nèi);穩(wěn)定性試驗(yàn):3000 r/min離心15 min,37℃放置21 d,4℃放置1年,疫苗均未出現(xiàn)分層現(xiàn)象,說(shuō)明疫苗具有良好的的穩(wěn)定性。

2.5 疫苗效力檢驗(yàn)

2.5.1 間接ELISA檢測(cè)家兔體內(nèi)抗體水平 首免組和二免組家兔血清中IgG抗體效價(jià)均有明顯的上升,峰值均為1∶9600,至免疫后的21周首免組的抗體效價(jià)仍能維持在1∶1000,二免組為1∶4000。見(jiàn)圖3。

2.5.2 中和抗體試驗(yàn)檢測(cè)家兔體內(nèi)抗體水平 首免組和二免組家兔,抗體效價(jià)變化規(guī)律性基本一致,均在第3周抗體效價(jià)明顯升高,峰值均為1∶1800,于免疫后14周抗體效價(jià)開(kāi)始緩慢下降,免疫后21周,首免組的抗體效價(jià)仍維持在1∶119,二免組為1∶230。見(jiàn)圖4。

3 討論

本試驗(yàn)利用我國(guó)豬輪狀病毒分離毒株JL94株制備油乳劑滅活疫苗,免疫家兔,通過(guò)細(xì)胞中和試驗(yàn)和間接ELISA試驗(yàn),證明以該病毒為種毒,可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和保護(hù)性抗體,并呈現(xiàn)出一定的抗體消長(zhǎng)規(guī)律。

為了保證疫苗的免疫原性,制備病毒抗原時(shí)使病毒液的感染力滴度達(dá)到106TCID50/mL以上[9]。鑒于此,本試驗(yàn)首先將豬輪狀病毒分離株JL94株在MA-104細(xì)胞系上傳代適應(yīng)細(xì)胞,制備基礎(chǔ)種毒。該病毒傳至第58代,滴度達(dá)到108.25TCID50/mL,對(duì)其擴(kuò)大培養(yǎng),制備出生產(chǎn)種毒,作為制備疫苗的抗原液。

通過(guò)細(xì)胞中和試驗(yàn)和間接ELISA試驗(yàn)表明,首免組和二免組家兔血清抗體均升高明顯,于免疫后21周首免組中和抗體效價(jià)和ELISA效價(jià)分別為1∶119和1∶1000;二免組為 1∶230和1∶4000。因輪狀病毒主要感染仔豬,符合疫苗免疫仔豬后免疫持續(xù)期的要求。比較兩種抗體檢測(cè)方法可以看出,ELISA檢測(cè)抗體變化規(guī)律和中和試驗(yàn)檢測(cè)抗體變化規(guī)律大致相同,均在免疫后3周左右抗體效價(jià)明顯升高,持續(xù)到16周開(kāi)始呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。同時(shí)也可看出,一次免疫和兩次免疫的效果相當(dāng),進(jìn)行一次免疫即可。ELISA抗體檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易行、操作方便,而中和試驗(yàn)檢測(cè)方法比較繁瑣,因此,在實(shí)際檢測(cè)中采用ELISA方法也能反應(yīng)疫苗免疫的有效免疫應(yīng)答水平。上述試驗(yàn)結(jié)果為該疫苗的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),疫苗對(duì)仔豬的保護(hù)尚待進(jìn)一步研究。

[1]李國(guó)平,伊順仁,李發(fā)晨,等.仔豬 輪狀病毒的感染情況調(diào)查[J].福建畜牧獸醫(yī),1999,21(2):44-45.

[2]陳淑紅,王新生,師東方,等.豬輪狀病毒的分離鑒定及部分特性研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,26(1):42-44.

[3]陳淑紅,師東方,李一經(jīng).豬輪狀病毒地方株JL94株VP6基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,35(4):443-448.

[4]邊亞娟,林長(zhǎng)水,王玉玲,等.抗豬輪狀病毒VP6單克隆抗體的制備與鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,37(4):489-491.

[5]文喻玲,趙慶歡,于洋,等.氯化銫密度梯度離心純化輪狀病毒[J].中華現(xiàn)代內(nèi)科學(xué)雜志,2007,4(3):195-199.

[6]曹竹婷,楊少華,楊宏軍,等.檢測(cè)牛輪狀病毒抗體間接ELISA方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,31(3):213-214.

[7]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].2001版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社,2001:10.

[8]李樂(lè),苗海生,廖德芳,等.口蹄疫疫苗中免疫原含量和中和抗體滴度的關(guān)系[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2009,36(1):88-90.

[9]Johansen K,Schroder U,Svensson L.Immunogenicity and protective efficacy of a faformalin-inactivated rotavirus vaccine combined with lipidadjuvants[J].Vaccine,2003,21(5-6):368-375.