白芍水提物對cAMP-磷酸二酯酶活性影響及其抗炎效果觀察

陳益山,鞏忠福,姜代勛,李 佳,陳 麗,任 超,穆 祥,陳 武

(1.獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室,北京 昌平 102206;2.北京農學院動物科學技術學院,北京 昌平 102206;3.中國獸醫藥品監察所,北京 海淀 100081)

白芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia lacti f lora Pall)的干燥根,具有平肝止痛、養血調經、斂陰止汗之功效[1]。藥理研究表明,其有抗炎、解痙、護肝、免疫調節等作用。研究表明,臨床上常見炎癥性疾病多與中性粒細胞的炎性反應密切相關[2-3],而磷酸二酯酶(PDE)可以通過調節細胞內cAMP水平發揮抗炎作用[4],本試驗通過檢測白芍水提物對中性粒細胞PDE活性和炎癥病理模型的影響,分析其抗炎的相關機理與效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠60只,體重150～180 g,購于中國科學院遺傳與發育研究所實驗動物中心。

1.2 主要試劑 cAMP、Rolipram、角叉菜膠、弗氏完全佐劑(Sigma公司),PBS(pH值7.4),鈣鎂PBS(pH值7.4),中藥白芍飲片(北京同仁堂藥店)。

1.3 白芍水提物的制備 白芍水提物的制備方法參照韓太云等人的方法[5],將購買的白芍飲片用蒸餾水淋洗1次,加蒸餾水煎煮2次,煎液減壓濃縮至1 g/mL生藥。加無水乙醇使其濃度達到70%,邊加邊攪拌,4℃放置24 h,取上清液用氫氧化鈉調pH值為7.5～8.0,放置12 h,取上清液揮發掉乙醇,將藥液濃縮至1 g/mL生藥。放置12 h,離心取上清液濃縮干燥,得白芍水提物。

1.4 中性粒細胞cAMP-PDE活性檢測 中性粒細胞cAMP-PDE活性影響的檢測方法參考張冰等的方法[6]。cAMP濃度為100 μ mol/L,白芍水提物的反應濃度為10 mg/mL,陽性對照為Rolipram,反應濃度為 100 μ mol/L,均用 PBS配制。空白組:cAMP 40μL,對照組 :cAMP 40μL 、酶樣品 20μL,白芍水提物組:cAMP 40μ L、白芍水提物 10μL、酶樣品 20μL,Rolipram 組:CAMP 40μ L 、Rolipram 10.0μL、酶樣品 20μL,所有體系加 PBS 補足100μL 。

1.5 大鼠角叉菜膠致足腫脹模型試驗 將大鼠隨機分成6組,每組10只。白芍水提物設高、中、低3個濃度,分別小鼠腹腔注射白芍水提物10 g/kg、5 g/kg、2.5 g/kg體重;陽性對照組,腹腔注射Rolipram 2.75 mg/kg體重;正常對照組和模型組,腹腔注射等容積的生理鹽水。給藥30 min后,正常對照組每鼠右后足跖皮下注射0.1mL生理鹽水,其余各組每鼠右后足跖皮下注射1%角叉菜膠0.1mL造模。致炎前按照余華保等人[7]的玻璃容器法測定大鼠右后足跖的容積,致炎后2,4 h和6 h再測量3次,以mL為單位計算其腫脹。以致炎前后足跖容積的差值計算腫脹度,并算出各用藥組的抑制率,腫脹抑制率=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%。

1.6 大鼠佐劑性關節炎模型試驗 分組給藥同上1.5。正常對照組每鼠左后足跖皮下注射0.05mL的生理鹽水,其余各組每鼠左后足跖皮下注射完全弗氏佐劑0.05mL造模。致炎前用千分尺測量大鼠左后足跖的厚度,致炎后3 h、6 h、15 h再測量3次,以mm為單位計算其腫脹。以致炎前后足跖厚度的差值計算腫脹度,并算出各用藥組的抑制率。

1.7 數據處理 數據分析采用樣本間t檢驗。

2 結果與分析

2.1 白芍水提物對中性粒細胞cAMP-PDE活性的影響 白芍水提物在10 mg/mL的反應濃度下,能極顯著的抑制cAMP-PDE4的活性(P＜0.001),其抑制率顯著高于Rolipram組。結果見表1。

表1 白芍水提物及Rolipram對cAMP-PDE活性的影響

2.2 白芍水提物對大鼠角叉菜膠致足腫脹的影響與空白對照組相比較,模型組致炎后大鼠足跖容積極顯著性變大(P＜0.001),說明造模成功。白芍水提物各濃度組及Rolipram組對大鼠足腫脹在致炎后2 h、4 h和6 h均有顯著抑制作用(P＜0.05),并且隨劑量的增加,其足腫脹度逐漸減小,抑制率逐漸提高,結果見表2和表3。

2.3 白芍水提物對大鼠佐劑性關節炎的影響 模型組大鼠左后足跖極顯著腫脹(P＜0.001)。白芍水提物各濃度組及Rolipram組給藥后的大鼠原發性足跖腫脹均受到顯著的抑制(P＜0.05),并且隨劑量的增加,其足跖腫脹度逐漸減小,抑制率逐漸提高,結果見表4和表5。

3 討論

大部分研究報道所用白芍的成分都是通過有機溶劑乙醇萃取獲得[8],考慮到傳統中藥均采用水煎煮的方法,水溶性成分可能更能真正代表其傳統作用成分。因此,本試驗通過水提醇沉法提取了白芍中的水溶性成分,檢測其對cAMP-PDE活性的影響,觀察其抗炎效果并分析機理。

表2 白芍水提物對大鼠足腫脹的影響 (mL)

表3 白芍水提物各組大鼠足爪腫脹度(mL)和抑制率(%)

表4 白芍水提物對佐劑性關節炎大鼠足跖腫脹度的影響 (mm)

表5 白芍水提物各組大鼠足跖腫脹度(mm)和抑制率(%)

結果表明,白芍水提物對中性粒細胞中cAMPPDE活性具有極顯著的抑制作用。并且對大鼠角叉菜膠致大鼠足腫脹和佐劑性關節炎的足腫脹兩種炎癥模型均顯示出了極顯著的抗炎效果,并與劑量呈正相關。大鼠角叉菜膠致大鼠足腫脹和佐劑性關節炎的發生與炎癥局部中性粒細胞活化和浸潤及前列腺素E2合成增加有關[9-10],而cAMP具有抑制中性粒細胞活化及前列腺素 E2過度合成的作用。PDE是cAMP的惟一水解酶,對調節細胞PDE水平起著關鍵性作用。因此,白芍水提物的作用可能是通過抑制PDE活性,升高cAMP水平,進而抑制大鼠角叉菜膠致足腫脹和佐劑性關節炎的足跖腫脹部位中性粒細胞活化和浸潤及前列腺素E2增加,從而發揮良好的抗炎效果。

白芍水提物中含有的具體抗炎成分及臨床抗炎療效有待進一步研究。

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