狂犬病病毒ERA株糖蛋白基因的克隆與序列分析

高明華,張志琰,樊慶徳,楊曉剛,夏咸柱

(1.呼倫貝爾學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所,吉林 長(zhǎng)春 130062)

狂犬病病毒(RV)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒屬(Lyssavirus),是人獸重要共患狂犬病的病原[1-2]。根據(jù)血清學(xué)試驗(yàn)和種屬發(fā)生規(guī)律,已知的狂犬病病毒及狂犬病相關(guān)病毒分為5個(gè)血清型[3-4]和7個(gè)基因型[5-7]。7個(gè)基因型又分屬兩個(gè)不同的遺傳進(jìn)化群[8]。基因Ⅰ型包括在自然界中流行的野毒株和固定毒株(如 ERA、SRV9、CVS、PV、Flury、aG株等)。RV結(jié)構(gòu)蛋白包括核蛋白(N)、糖蛋白(G)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)和依賴RNA的RNA多聚酶(L)。糖蛋白是狂犬病病毒的主要保護(hù)性抗原,是惟一誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的蛋白,其免疫作用與全病毒疫苗相當(dāng)[9-10]。鑒于糖蛋白在RV結(jié)構(gòu)中的重要地位和在免疫上的重要作用,我們對(duì)RV ERA株G蛋白基因進(jìn)行了克隆和序列分析,以期了解該毒株G基因的分子生物學(xué)背景和G蛋白的抗原性,同時(shí)也為進(jìn)一步研究狂犬病安全有效的基因工程疫苗和新型檢測(cè)方法奠定必要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、質(zhì)粒、菌種與主要試劑 RV ERA株由本實(shí)驗(yàn)室保存;反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、RNase抑制劑、T4DNA 連接酶 、dNTPs、pMD18-T 載體、限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;經(jīng)典總RNA抽提試劑盒、Taq plus DNA聚合酶和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;E.coli JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的RV G基因序列,并分析其內(nèi)部酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物。上游引物:5′-AGCGAATTCGATGGT TCCTCAGGCTCTCCTGTT TG-3′,下游引物 :5′-TTAG CGGCCGCCTCACAGTCT -GGTCTCACCCCCA-3′為進(jìn)一步克隆和構(gòu)建表達(dá)載體需要,分別在上、下游引物的5′端引入 EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線部分),并加3個(gè)保護(hù)性堿基。

1.3 病毒培養(yǎng)及總RNA提取 按常規(guī)方法培養(yǎng)病毒。采用經(jīng)典總RNA抽提試劑盒提取總RNA。

1.4 RV ERA株G基因RT-PCR擴(kuò)增、克隆與序列分析 RT-PCR擴(kuò)增目的基因,產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析,回收目的DNA片段,并與pMD18-T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 JM109,并用Amp+LB瓊脂平板篩選。酶切鑒定重組質(zhì)粒,正確者命名為pMD-G,送上海聯(lián)合基因生物公司進(jìn)行測(cè)序[11-12]。用軟件分析序列并與其他毒株G基因進(jìn)行同源性比較。

1.5 ERA株與其他不同毒株G基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列分析 用分子生物學(xué)軟件對(duì)測(cè)定的G基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析;ERA株與GenBank上登錄的其他國(guó)內(nèi)外不同RV毒株糖蛋白主要抗原表位、糖基化位點(diǎn)和神經(jīng)毒性殘基等進(jìn)行比較和分析。

2 結(jié)果

2.1 G基因的擴(kuò)增與克隆 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小一致(圖1)。回收該片段,用pMD18-T載體克隆,篩選得到重組質(zhì)粒pMD-G,經(jīng)EcoRⅠ酶切,得到約4267 bp的DNA大片段;經(jīng)EcoRⅠ和 NotⅠ雙酶切,得到約1575 bp的插入DNA片段和2692 bp的載體大片段,表明G基因已克隆入 T載體中(圖2)。以pMD-G為模板,用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到了1575 bp大小的核酸片段,表明已正確克隆了G基因。

2.2 序列測(cè)定結(jié)果及ERA株與其他毒株G基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比較 序列測(cè)定結(jié)果,RV ERA株G蛋白基因全長(zhǎng)1575 bp,編碼524個(gè)氨基酸。分析表明,在推導(dǎo)的G蛋白氨基酸序列中,第1～19位和440～461位氨基酸是兩個(gè)明顯的疏水區(qū),前一個(gè)疏水區(qū)構(gòu)成該蛋白的信號(hào)肽序列,后一疏水區(qū)推測(cè)是該蛋白的跨膜區(qū)。測(cè)序結(jié)果與GenBank登錄的RV ERA株核苷酸序列完全一致,說(shuō)明本室保存的毒株在連續(xù)傳代過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生變異。

ERA株與GenBank中發(fā)表的其他基因 I型RV毒株相比,G基因核苷酸的同源性為89.1%～99.1%,推導(dǎo)氨基酸序列的同源性為89.7%～99.3%。序列比較發(fā)現(xiàn),不同RV各固定毒株糖蛋白的氨基酸同源性有一定的差異,其中穿膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)差異較大(同源性50%～60%),而膜外區(qū)的保守性略高(同源性大于90%)。

2.3 糖基化位點(diǎn)與神經(jīng)毒性殘基分析 用PROSITE軟件分析發(fā)現(xiàn),推導(dǎo)的RV ERA株G蛋白上存在3個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)(Asn37,247,319),與RV其他毒株相比糖基化位點(diǎn)數(shù)目和部位略有差異(CVS株為Asn37,319;PV株為Asn37,158,247,319;HEP株為Asn37,158,204,319;Kelev株為 Asn37,319;Mokola株 Asn202,319),其中第Asn37位糖基化位點(diǎn)為基因I型RV共同擁有的,而Asn319位糖基化位點(diǎn)為多數(shù)野毒株和固定毒株共同擁有的。

糖蛋白神經(jīng)毒性殘基分析,ERA株、PV株和CVS株均為Arg333;HEP株為Glu333;Kelev株為Gln333;Mokola為Asp333。

2.4 G蛋白主要抗原表位分析 RV ERA株與SRV9、PV和CVS等標(biāo)準(zhǔn)毒株相比較,G蛋白在疏水性、Jameson-Wolf抗原表位和表面極性均有其明顯的特點(diǎn)。Jameson-Wolf抗原表位分析表明,與PV-11相比,在175-183位氨基酸殘基上抗原表位指數(shù)明顯升高;CVS相比,在145-154、423-430、492-500位氨基酸殘基上抗原表位指數(shù)明顯升高,而在380-392位氨基酸殘基上抗原表位指數(shù)明顯降低;與SRV-9相比,在 185-195位、273-280位氨基酸殘基上抗原表位指數(shù)明顯降低。

另外,在推導(dǎo)的RV ERA株G蛋白序列N端260～267位氨基酸也存在一個(gè)非常保守的序列‘LHDFRSDE',此序列是G蛋白抗原表位V-線性表位的核心,該表位由位于254～275位的氨基酸殘基組成,在目前所測(cè)序的毒株(包括固定毒株和分離株)中均非常保守。

3 小結(jié)與討論

3.1 成功克隆和表達(dá)了狂犬病病毒ERA株G基因。糖蛋白位于狂犬病病毒分子表面,是病毒的保護(hù)性抗原,占病毒總蛋白的40%。其糖基化位點(diǎn)與神經(jīng)毒性殘基分析結(jié)果表明,由于該疫苗株存在Asn319位糖基化位點(diǎn),與多數(shù)野毒株和固定毒株共同擁有的;并且,糖蛋白第333位氨基酸為神經(jīng)毒性殘基Arg333,因此全病毒有一定的潛在神經(jīng)毒性,只可用于滅活疫苗的制備。由于RV ERA株糖蛋白有明顯的優(yōu)勢(shì)抗原表位,因此可用G基因作為靶基因研制安全有效的基因工程疫苗。

3.2 狂犬病是人類和多種動(dòng)物致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病。在我國(guó)狂犬病發(fā)生主要分布在南方部分省區(qū),且近幾年呈上升趨勢(shì),穩(wěn)居我國(guó)法定報(bào)告?zhèn)魅静“l(fā)病總數(shù)和死亡總數(shù)之第二位,病死率和死亡率則位居各傳染病首位,犬是最主要的儲(chǔ)存宿主和傳播宿主。因此研制安全有效的獸用疫苗和建立特異敏感的快速診斷方法對(duì)于防制狂犬病是非常必要的。我們對(duì)RV ERA株進(jìn)行了詳細(xì)的分子生物學(xué)研究,對(duì)該毒株G、N等兩種主要結(jié)構(gòu)蛋白基因進(jìn)行了克隆和序列分析,并進(jìn)行了表達(dá),其目的為進(jìn)一步研制安全有效的基因工程疫苗和快速診斷試劑,奠定良好的基礎(chǔ)。

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