奶牛乳汁體細胞數的快速檢測及其臨床意義

楊紅英,高 健,劉修權,蘇敬良,韓 博

(1.寧夏吳忠市動物疾病預防控制中心,寧夏 吳忠 751100;2.中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193)

乳汁體細胞數是反映奶牛隱性乳房炎的一個重要指標,我國規定隱性乳房炎的判定標準為體細胞數大于50萬/mL。目前,檢測奶樣體細胞數的方法包括間接計數法和直接計數法。間接計數法包括加州乳房炎檢測法(CMT)及其衍生的北京乳房炎檢測法(BMT)、上海乳房炎檢測法(SM T)[1]等,均屬定性計數,多依靠檢測者的經驗而定,結果不夠精確。直接計數法包括體細胞電子計數法(ESCC)、桶奶細胞計數法(BMCC)、牛只細胞計數法(ICCC)等[2],可對SCC進行定量檢測,但是檢測費用高,使用不方便。便攜式體細胞計數儀C-Reader[3]由韓國研制,具有價格低廉、輕巧便攜、操作方便和快速準確等特點,能精確測定SCC。本試驗旨在用便攜式體細胞計數儀C-Reader,定量檢測奶樣中的SCC,以此快速判定奶牛隱性乳房炎,從而及時制定治療方案,減少乳房炎引起的損失。

1 材料與方法

1.1 待檢奶樣 自2008年3月份至2008年8月份選擇北京及河北地區10個牛場的111頭無乳房炎癥狀奶牛,無菌采集428份乳汁,置于冰盒送回實驗室,做SCC檢測。

1.2 主要儀器 便攜式體細胞計數儀C-Reader(韓國Digital Bio Technology公司),立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊公司),電熱恒溫鼓風干燥箱DHX-9073B型(上海福瑪設備有限公司),電熱恒溫培養箱(上海福瑪設備有限公司),臺式離心機(上海安亭科學儀器廠),光學顯微鏡(Olympus公司),超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司),奶樣瓶(北京奶牛中心)。

1.3 培養基及相關試劑 普通瓊脂培養基,麥康凱瓊脂培養基,7.5%氯化鈉甘露醇瓊脂培養基,KF鏈球菌瓊脂,營養肉湯培養基,腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管GYZ-15 e,葡萄球菌屬細菌生化編碼鑒定管TH-16 S(杭州天和微生物試劑有限公司),TSA瓊脂,TSB肉湯(美國BD公司),靛基質,苯丙氨酸,硝酸鹽還原試劑,葡萄糖酸鹽,甲基紅(MR),馬尿酸鹽,溴甲酚紫、溴麝香草酚藍,液體石蠟、丙三醇等(杭州天和微生物試劑有限公司),BMT診斷液(北京奶牛中心),含5%去纖維綿羊血的TSA和普通瓊脂平板均自行配制。

1.4 體細胞數檢測 采集A牛場53份奶樣,同時用BMT法和C-Reader對其體細胞數進行定性和定量檢測。BMT法是根據測試盤上有無絮狀物及沉淀程度來判定結果(判斷標準見表1);C-Reader可直接顯示出奶樣中的體細胞數。

表1 BMT法判斷隱性乳房炎的標準

1.5 隱性乳房炎奶樣的致病菌分離鑒定 將每份隱性乳房炎奶樣(SCC＞50萬/mL)5mL加入15mL離心管中,6000 r/min離心5 min,棄上清,無菌取0.1mL干酪樣沉淀接種于5%去纖維綿羊血-TSA培養基,37℃培養24 h。挑取特征菌落于TSB肉湯中增菌培養18 h,然后分別接種于麥康凱瓊脂培養基、7.5%氯化鈉甘露醇瓊脂培養基、KF鏈球菌瓊脂培養基進行純化培養。純化培養物進行革蘭染色鏡檢,初步判定致病菌的種屬。挑選純化好的單個菌落接種于微量發酵管中,37℃培養24～72 h,做生化鑒定。

2 結果與分析

2.1 BMT法與C-Reader法定性和定量檢測53份奶樣的SCC。見表2。

表2 A牛場乳汁BMT法和C-Reader計數法檢測SCC (×105cells/mL)

從表2看出,53份奶樣分別用C-Reader法和BMT法進行定量和定性檢測,45份檢測結果是相符的,相符率僅為84.9%。由于BM T法通常是檢測者依其個人經驗主觀判斷,因而使結果造成較大的誤差。C-Reader法能客觀精確地定量測定乳汁中的體細胞數,準確地反應隱性乳房炎的發病率。

2.2 北京及河北地區10個牛場的隱性乳房炎發病率 隱性乳房炎頭發病率是至少有一個乳區為隱性乳房炎的奶牛頭數占檢測的所有奶牛數的百分比。乳區發病率指采集的隱性乳房炎的奶樣占總奶樣數的百分比。測試結果見表3、表4和圖1。

表3 各牛場的隱性乳房炎頭發病率

表4 各牛場體細胞數0～20萬/mL、20萬/mL～50萬/mL及50萬/mL以上的奶樣數

從表3和表4可知,北京及河北地區的隱性乳房炎頭發病率為54.1%,乳區發病率為23.3%。比楊章平等報道的發病率低[4]。各牛場的發病率差異較大,乳區發病率比頭發病率更能客觀地體現出牛場的隱性乳房炎發病情況。由圖1可知,除F牛場外,其他9個牛場體細胞數在0～20萬/mL的奶樣比例均明顯高于體細胞數在20萬/mL～50萬/mL的奶樣比例。10個牛場體細胞數0～20萬/mL的奶樣占63.6%,而20萬/mL～50萬/mL的奶樣占13.1%,前者比例遠高于后者。

2.3 奶牛隱性乳房炎致病菌的分離及鑒定 100份隱性乳房炎奶樣接種5%去纖維綿羊血-TSA培養基,82份奶樣細菌培養為陽性,陽性率為82.0%。其中,在5%去纖維綿羊血-TSA培養基上,64份奶樣有1種特征性致病菌生長,占78.0%;15份奶樣有2種特征性細菌生長,占18.3%;僅有3份奶樣有3種特征性致病菌生長,占3.7%。

分離到的主要致病菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌在5%去纖維綿羊血-TSA培養基、麥康凱瓊脂培養基、7.5%氯化鈉瓊脂培養基和KF鏈球菌培養基上的形態特征和革蘭染色結果見表5。

表5 乳汁分離菌株的平板培養特性及革蘭染色結果

隱性乳房炎主要致病菌所占比例:經過致病菌的選擇性培養和生化鑒定,對采集的100份隱性乳房炎乳樣接種培養,致病菌培養陽性率為82.0%。在分離得到的103株致病菌中,鑒定出了7個種屬的100株致病菌。包括金黃色葡萄球菌64株(64.0%),表皮葡萄球菌11株(11.0%),大腸桿菌8株(8.0%),無乳鏈球菌8株(8.0%),停乳鏈球菌2株(占2.0%),傷寒沙門菌 5株(占 5.0%),肺炎克雷伯氏菌2株(2.0%)。見圖2。

上述結果顯示,在北京及周邊牛場中,引起隱性乳房炎的最主要致病菌為金黃色葡萄球菌。這與李宏勝[5]報道的停乳鏈球菌占37.78%、大腸桿菌占24.34%、無乳鏈球菌占15.56%、金黃色葡萄球菌占13.33%、綠膿桿菌占4.44%、克雷伯氏菌占2.22%和變形桿菌占2.22%和易本馳[6]報道的葡萄球菌占35.63%,鏈球菌占14.94%,革蘭陰性桿菌占49.43%差異較大。這主要與抗生素普遍應用使鏈球菌所占比例有較大程度的降低[7]和地域性對致病菌種屬變化影響較大有關[8]。總之,本試驗用C-Reader對北京及河北地區的奶牛隱性乳房炎進行了快速定量檢測,并對引起隱性乳房炎的主要致病菌進行了分離及鑒定,指出北京及河北地區導致隱性乳房炎的致病菌主要是金黃色葡萄球菌。

[1]雷曉薇,王根林,韓兆玉.應用體細胞計數監測奶牛隱性乳房炎[J].畜牧與獸醫,2003,35(12):35-37.

[2]歐陽五慶,唐光武,席文平,等.牛、羊隱性乳房炎快速診斷法研究-SMT法和BMT法的效能比較[J].黑龍江畜牧獸醫,1995(5):12-14.

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[4]楊章平,王健,丁煥峰,等.奶牛隱性乳房炎的發生規律的研究[J].中國奶牛,1998(1):18-21.

[5]李宏勝.我國部分地區個體奶牛場乳房炎流行病學調查[M].蘭州:甘肅農業大學,2004:7.

[6]易本馳.奶牛隱性乳房炎的流行病學及病原調查[J].中國畜牧獸醫,2006,33(12):37-38.

[7]Forsman P,Tilsala-Timisjarvi A,Alatossava T.Identification of staphylococcal and streptococcal causes of bovine mastitis using 16S-23S rRNA spacer regions[J].Microbiology,1997,143:3491-3500.

[8]Fournier C,Kuhnert P,Frey J,et al.Bovine staphylococcus aureus:association of virulence genes,genotypes and clinical outcome[J].Research in Veterinary Science,2008,85:439-448.