豬akirin2基因的克隆與真核表達

曹金鎖,柳 超,蔣朋飛,趙振華,陳新雨,張德禮

(西北農林科技大學動物醫學院病毒免疫與生物信息研究室生物信息研究中心分子病毒免疫與腫瘤系統生物學研究組,陜西 楊凌 712100)

先天性免疫是機體防御病原體感染的第一道防線,而ak irin2是先天性免疫系統的一個重要功能基因[1-2]。Akirin2蛋白嚴格定位于細胞核,參與NF-κ B通路,但其作用機制尚未明確。小鼠akirin2基因敲除試驗表明,Akirin2蛋白是Toll樣受體,腫瘤壞死因子和白介素1受體信號通路中的重要核因子[1]。體外細胞轉染試驗證實,該蛋白的過量表達能明顯促進IL-6和其他免疫因子的表達[1,3]。為探討akirin2基因在豬體內的功能,本研究結合生物信息學方法和分子生物學試驗,依照人akirin2基因序列克隆到豬源a k irin2基因,對基因進行染色體定位預測與蛋白進化分析,從序列本身掌握ak irin2基因特點。構建真核表達載體成功進行瞬時轉染,為深入研究ak irin2奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 組織和細胞來源 健康長白豬的脾臟;豬臍靜脈血管內皮細胞系(SUVEC)為張彥明教授饋贈;pEGFP-C1質粒為本實驗室保存。

1.2 試劑 Trizol試劑購自Invitrogen公司;RTPCR試劑盒購自Fermentas;Taq DNA,內切酶SalⅠ和BamHⅠ均購自TaKaRa(大連)公司;抗GFP抗體,膠回收試劑盒購自天根公司;羊抗鼠 IgG/HRP購自北京博奧森公司;質粒提取試劑盒購自Omega公司;Lipofectamine 2000 Regent購自Invitrogen公司;胎牛血清購自 Hyclone公司;DMEM細胞培養基購自Gibco公司。

1.3 豬akirin2基因的電子克隆與引物設計 登陸NCBI,以人 a k irin2基因(NC_000006.11)為種子序列,在豬EST數據庫中進行比對拼接得到豬a kirin2基因預測序。設計引物為上游5′-GAGTCGAC ATGGCGTGCGGAGCTACT-3′,下游 5′-GACGGGA TCCGTCATGAAACATAACTAGCAG -3′,GTCGAC:SalⅠ酶切位點;GGATCC :BamHⅠ酶切位點。

1.4 akirin2基因的克隆和鑒定 取健康長白仔豬的脾臟,采用Trizol法提取總RNA,RT-PCR法得到ak irin2的編碼區,將 PCR產物與 pMD-18TSimple載體連接,菌液送到北京三博遠志生物技術公司進行測序。

1.5 ak irin2基因序列分析 在線軟件(http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp)預測 NLS(Nuclear localization signal)[4],使用APSSP2在線軟件(http://www.imtech.res.in/raghava/apssp2)對蛋白二級結構進行預測[5]。CluxtalX 1.8軟件將多物種的Akirins蛋白序列進行多序列比對,使用MEGA4.0軟件做進化樹[1-6]。

1.6 ak irin2基因真核載體的構建與鑒定 將pMD-akirin2重組質粒進行SalⅠ和BamHⅠ雙酶切,pEGFP-C1質粒經過同樣的雙酶切和膠回收,將pEGFP-C1和目的片段akirin2在 T4連接酶作用下4℃過夜,轉化至感受態細胞DH5α中,將重組質粒送至北京三博遠志生物技術公司進行測序。

1.7 SUVEC培養和質粒轉染細胞 培養豬臍靜脈血管內皮細胞(SUVEC),細胞形態為鋪路石狀,用含10%胎牛血清的高糖DMEM進行培養,每3 d傳代1次。將細胞培養在六孔板中,按照脂質體2000操作說明進行轉染,24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況[8]。

1.8 Western blot檢測目的蛋白 參照《分子克隆實驗指南》做Western blot檢測目的蛋白,一抗為抗GFP抗體(工作濃度為1∶2000),二抗為羊抗鼠IgG/HRP(工作濃度為1∶3000)。

2 結果

2.1 通過RT-PCR法得到目的序列 從豬脾臟中提取RNA,經RT-PCR擴增得到與預期大小相一致的核酸片段。

2.2 序列分析結果 豬Akirin2編碼203個氨基酸,第22～27位氨基酸(PKRRRC)序列為核定位序列,該蛋白以Coil(無規卷曲)和α-Helix(α-螺旋)為主。豬akirin2基因被準確定位在豬第1號染色體上,此段豬基因組序列登陸號為CU633759,在第164313-185326位之間。外顯子分別編碼78個氨基酸,48個氨基酸,50個氨基酸和27個氨基酸。3個內含子大小分別為16441 bp,2406 bp和1358 bp。

2.3 豬Akirin2蛋白進化分析 最小進化法構建的無根進化樹顯示:豬的Akirin2蛋白與牛的Akirin2蛋白保持高度的同源性。同時各物種間的Akirin2進化保守型要高于 Akirin1。進化樹明顯分為三大部分:無脊椎動物的Akirin,脊椎動物的Akirin1和脊椎動物的Akirin2[1-3]。圖中符號標示:Dm,(果蠅);Ag,(按蚊);Am,(蜜蜂);Tc,(赤擬谷盜);Gg,(雞);Hs,(人);Mm,(小鼠);Xl,(爪蟾);Dr,(斑馬魚);Bt,(牛);Ss,(豬)。

2.4 真核重組質粒pEGFP-Akirin2瞬時轉染結果在轉染24 h后,使用熒光倒置顯微鏡觀察轉染的SUVEC細胞。a和b分別為重組質粒轉染的SUVEC細胞,a為熒光下細胞形態,b為同一細胞區域自然光下細胞形態;c為空 pEGFP-C1質粒轉染SUVEC細胞結果。d為未轉染的EC細胞。通過熒光觀察初步判定目的蛋白已在SUVEC細胞中表達。見圖2。

圖2 pEGFP-Akirin2和pEGFP-C1轉染SUVEC細胞24 h后熒光顯微鏡檢測(100×)

2.5 Western blot檢測結果 Akirin2蛋白分子量為22.5 ku,EGFP蛋白自身蛋白分子量為27 ku,則EGFP-Akirin2融合蛋白分子量為 49 ku左右。Western blot檢測出的融合蛋白大小與預期分子量一致,證明EGFP-Akirin2融合蛋白在SUVEC細胞中得到表達。見圖3。

3 討論

圖3 Western blot檢測

比較基因組學與基因數據庫的共享為基因識別提供了條件。人基因組與豬基因組存在較高的同源性,以人的基因序列為種子序列,在豬EST數據庫和基因組數據庫中進行豬新基因的識別與克隆,為研究豬感染與免疫新基因提供新途徑。本研究通過分子生物學技術得到豬Akirin2完整編碼區證實了豬ak irin2基因確實存在。將編碼區與豬基因組序列比對,結合內含子首尾的GT-AT規律,確認豬akirin2基因含有4個外顯子并定位于豬1號染色體。這一結果可為研究Akirin2蛋白功能提供參考價值,為研究各個外顯子功能和Akirin2蛋白構象提供幫助。通過構建多物種Akirin進化樹為研究各物種之間的進化關系提供佐證,為從進化角度研究低等動物與高等動物之間Akirin調控異同提供數據。本試驗成功將a k irin2基因構建到pEGFPC1真核表達載體上,實現豬 a k irin2基因在SUVEC細胞中的瞬時表達,保持了Akirin2蛋白的原有構象,為進一步研究akirin2基因功能奠定基礎。由于豬和人的基因組序列和蛋白質有著高度同源性,因此以豬為模型研究哺乳動物免疫調控機制,將直接為研究人體相應蛋白提供數據支持。單獨的Akirin2蛋白并不起作用,因此要完全了解Akirin2的功能還需要同時研究多個免疫相關基因[1]。

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