致雞產蛋下降禽病原的檢測基因診斷芯片的研制及臨床應用

張 偉,任素芳,田振宇,鄭彤彤,張秀美,徐懷英

(1.山東省農業科學院,山東 濟南 250100;2.山東澳蘭生物工程研究院,山東 青島 266101)

近年來,禽的病毒病變得更加復雜,混合感染﹑交叉感染已成為目前疾病的顯著特征,本研究旨在現有探針反相雜交技術的基礎上融合基因芯片的基本原理,將導致雞產蛋下降的常見6種病原的高度保守片段(探針)用物理和化學的方法固定在硝酸纖維膜上,制成臨床診斷用低密度基因芯片。現將研究情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要毒株與試劑 NDV(F48E9)、H9(A/Chicken/Guangdong/SS/94)、IBV(M41)、EDS-76(B4)、ILT(Blen)、MG(NB72)均購自中國獸醫藥品監察所;裂解液、(預)雜交液、雜交洗滌液、底物液、酶聯緩沖液、顯色底液由研究室配制[1]。

1.2 6種病原探針引物的設計 寡核苷酸引物根據GenBank中已發表的序列分別查找到NDV、AIV 、IBV 、EDS76、ILT 、MG 多條全長序列,使用DNAStar分析每種病毒的高度保守序列[2-3]。用Oligo 6.0軟件設計合適的引物見表1。

1.3 6種病原探針質粒的克隆構建 提取6種病原的核酸擴增、純化與pMD18-T載體連接,隨后轉入JM109大腸桿菌感受態細胞,篩選重組克隆質粒[3]。

1.4 基因芯片的制備 將核酸探針進行純化并定量稀釋到100 ng/μL,用微量點樣器點在預處理的硝酸纖維素膜上[4]。在電熱鼓風干燥箱中80℃烤膜2 h,完成基因芯片的制備。

表1 DNA陣列引物序列

1.5 檢測樣品的制備和標記 取預處理的組織勻漿液采取堿裂解的方法提取核酸。將6種病原混合引物(各20 pmol/μ L)加入反轉錄體系進行轉錄。轉錄中加生物素Bio-11-dUTP進行標記[5]。

1.6 基因芯片雜交和芯片掃描雜交結果的分析參照文獻[1]的方法進行(預)雜交。雜交完畢的芯片用掃描儀進行掃描分析,根據樣品的分析設置:讀數0.1以下為陰性,0.2以上為陽性,兩者之間為可疑[6]。

圖1 芯片掃描儀下的芯片整理數據

1.7 基因芯片的靈敏度檢測 為了檢驗本研究所建立方法的靈敏性,將NDV的感染尿囊液作10-1～10-10倍比稀釋,分成3份,一份做芯片檢測,一份做RT-PCR,另一份做病毒分離。

1.8 基因芯片的特異性試驗 將6種混合引物同時進行RT-PCR反應,依次減少一種引物進行芯片的特異性試驗。

1.9 基因芯片的動物試驗和臨床中試 將20只120日齡SPF雞隨機分成2組,每組10只,分別接種低致病性AIV H9。死雞及時送檢觀察病變,取心 、肝、脾、肺 、腎、胸肌 、腿肌 、翅肌、氣管、直腸、骨髓組織勻漿提取核酸。

2 結果

2.1 靈敏度試驗結果 芯片靈敏度高于RT-PCR和病毒分離,分別為RT-PCR和病毒分離的104倍和105倍。RT-PCR檢測雞胚感染尿囊液的最高稀釋度為10-7,病毒分離檢測雞胚感染尿囊液的最高稀釋度為10-8,而芯片可檢測到的最高稀釋度為10-11,見表 2和圖2。

表2 新城疫芯片靈敏度試驗

圖2 基因芯片的靈敏度檢測

2.2 特異性試驗結果 6種混合引物同時進行RT-PCR反應,依次減少的種毒核酸時進行芯片檢測,各芯片上特異性雜交點呈強陽性,非目的性雜交點為陰性。

2.3 動物試驗檢測結果 在不同的組織勻漿液中提取的核酸芯片檢測,基因芯片的靈敏度明顯高于RT-PCR和病毒分離,分別為病毒分離、RT-PCR的102和103倍。見表3。

2.4 臨床試驗結果 自2007年2月起開始應用以來,諸城綠安有限公司和濟寧天諾雅動物保健有限公司集中做試點,經對918例各種死淘病雞的檢測,檢出雞新城疫病毒感染的雞158例,傳染性支氣管炎病毒的病雞108例,雞減蛋綜合征病毒43例,低致病性禽流感病毒11例,雞毒支原體病14例,其中混合感染109例。

3 討論

本試驗采用基因芯片的基本原理,建立了檢測致雞產蛋下降疾病低密度基因芯片技術平臺。通過試驗證明,此項技術可對常見雞產蛋下降疾病做出迅速、準確、并行的鑒別。通過特異性試驗證明,此技術特異性良好。和其他病原無交叉反應,且芯片上不同病原間也無交叉反應,試驗結果與預期結果一致。本試驗方法采用雜交顯色技術,對結果也可目測判定,生產成本僅為數萬元,更有利于普及和推廣[7]。

表3 芯片檢測AIV感染動物試驗

[1]馬立人,蔣中華.生物芯片[M].北京:化學工業出版社,2002:101-260.

[2]殷震,劉景華.動物病毒學[M].2版.北京:科學出版社,1997.

[3]Joseph Sambrook,David W Russell.Molecular cloning:A Laboratory Manual[M].3rd ed.Publishiing Company of Science,2002:85-98.

[4]Cheng J,Xing W.T he Fronriers of Biochip Technology[M].New York:U.S.A.Kluwer Academic Publishers,2005.

[5]張偉,吳時友,尹燕博,等.狂犬病診斷基因芯片的建立和檢測應用的初步研究[J].中國預防獸醫學報,2008,30(2):136-140.

[6]Xing W,Cheng J.Experiments in Biochip Technologies[M].T singhua University Press,2006:184-193.

[7]Saif Y M.Diseases of Poultry[M].11st ed.Beijing:Publishiing China Agricultural University Press,2005.