利用菌落多重PCR方法進行不同動物來源多殺性巴氏桿菌鑒定的研究

趙 耘,杜昕波,李偉杰,陳 敏,康 凱

(中國獸醫藥品監察所,北京 海淀 100081)

多殺性巴氏桿菌是引起多種畜禽巴氏桿菌病的病原體,主要使動物發生出血性敗血癥或傳染性肺炎。本菌廣泛分布于世界各地。在同種或不同動物間可相互傳播,也可感染人。Carter G R等根據莢膜抗原的不同將本菌分為A、B、D、E和F五個血清型[1]。多殺性巴氏桿菌不同型之間其生物學差異很大,主要表現毒力和流行病學方面,各血清型之間交叉免疫保護性較低。已經證明KMT1基因是多殺性巴氏桿菌種特異性基因,而A、B、D、E莢膜型的特異基因則分別是 hyaD、bcbD、dcbD和 ecbJ基因[2-3]。本研究參照文獻報道針對上述特異基因合成6對引物建立多重PCR方法,并利用所建立的多重PCR方法對我所保存的48株不同動物來源的多殺性巴氏桿菌進行鑒定和莢膜血清型分型,同時與間接血凝試驗以及Biolog細菌快速鑒定系統進行比對,以期為巴氏桿菌病的臨床快速診斷提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 多殺性巴氏桿莢膜型菌參考菌株,引自英國皇家獸醫學院,現由中國獸醫藥品監察所菌種保藏中心保藏,多殺性巴氏桿菌分離菌株43株由中國獸醫藥品監察所菌種保藏中心保藏具體信息見表3;支氣管敗血波氏桿菌CVCC3000、胸膜肺炎放線桿菌CVCC259、大腸埃希菌CVCC195由中國獸醫藥品監察所菌種保藏中心保藏。

1.2 菌株培養 將凍干保存的多殺性巴氏桿菌用適量馬丁湯溶解,接種改良馬丁瓊脂斜面,37℃過夜培養,取斜面培養物劃線接種改良馬丁瓊脂平板(含4%馬血清和0.1%血紅素)、普通瓊脂平板以及麥康凱瓊脂平板,37℃培養24 h;支氣管敗血波氏桿菌和大腸桿菌是用適量的營養肉湯溶解凍干菌株,接種普通瓊脂斜面,37℃過夜培養,取斜面培養物劃線接種普通瓊脂平板,37℃培養24 h;胸膜肺炎放線桿菌是用適量添加0.02%輔酶I(NAD)、8%滅活小牛血清的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)溶解凍干菌株,接種添加0.02%輔酶Ⅰ(NAD)、8%滅活小牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)斜面,37℃過夜培養,取斜面培養物劃線接種添加0.02%輔酶Ⅰ(NAD)、8%滅活小牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)平板。分別取多殺性巴氏桿菌培養物涂片、革蘭染色。單菌落直接作為PCR反應的模板進行菌落PCR。

1.3 Biolog鑒定 參照文獻報道的方法進行[4]。

1.4 間接血細胞凝集試驗 參照文獻報道的方法進行[1]。

1.5 PCR引物合成 參考文獻報道的引物序列[2-3],由上海Invitrogen公司合成。將各引物濃度稀釋至 25 μ mol/L置-20℃保存備用。引物的序列為:KMTF:ATCCGCTATT TACCCAGTGG,KMTR:GCTGTAAACGAACTCGCCAC,AF:TG CCAAAATCGCAGTCAG,AR:TTGCCATCAT T GTCAGTG,BF:CAT TTATCCAAGCTCCACC,BR:GCCCGAGAGT T TCAATCC,DF:TTACAA AAGAAAGACTAGGAGCCC,DR:CATCTACCC ACTCAACCATATCAG,EF:TCCGCAGAAAAT TATTGACTC,ER:GCT TGCTGCTTGAT T TTG TG,FF:AATCGGAGAACGCAGAAATCAG,FR:T TCCGCCGTCAATTACTCTG。

1.6 PCR擴增 PCR反應體系為 50μL,依次加入 10×PCR 緩沖液(含25 mmol/L MgCl2)5μL、6對引物(25 μ mol/L)各 1μL 、dNTP(2.5 μ mol/L)4μL 、Taq 酶(5 U/μ L)1μL 、雙蒸水 28μL,用滅菌槍頭挑取平板上的單個菌落,懸浮于各PCR反應液中。PCR反應條件為:95℃預變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸 1 min,30個循環;最后72℃延伸10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 特異性檢測 利用以上方法分別對支氣管敗血波氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、大腸埃希菌進行多重PCR,以檢測其特異性。

1.8 多重PCR的初步應用 將本所保存的48株多殺性巴氏桿菌分別進行菌株培養、菌落多重PCR,并與Biolog細菌快速鑒定系統和間接血凝試驗結果進行比較。

2 結果

2.1 多殺性巴氏桿菌的菌體形態和培養特性 48株多殺性巴氏桿菌分離株與參考菌株在添加血紅素和血清的改良馬丁瓊脂平板上生長良好,菌落為中等大小、淡灰白色、圓潤、光滑、邊緣整齊、閃光的露珠狀小菌落;在麥康凱瓊脂平板上不生長;在普通瓊脂平板上生長貧瘠。顯微鏡下可見各菌株均為革蘭陰性球桿菌。

2.2 Biolog鑒定結果 Biolog鑒定中相似性(SIM)和位距(DIS)是2個重要的參數,表示測試結果與數據庫相應數據的匹配程度。當SIM＞0.75,DIS＜5.0時,為良好的匹配;SIM 值越接近于1,鑒定結果的可靠性越強。通常在SIM值大于0.5時,就可以確定菌株的分類地位。結果48株菌株SIM值均大于0.5,85%菌株DIS小于5,這表明48株菌株均為多殺性巴氏桿菌(表略)。

2.3 間接血凝試驗結果 各菌株間接血凝試驗結果見表1。共進行了43株多殺性巴氏桿菌的間接血凝試驗,結果10株豬源多殺性巴氏桿菌5株為B型,3株為A型,2株為D型;15株禽源菌株均為A型;5株牛源和2株羊源菌株均為B型;2株馬源菌株1株為A型,1株為B型;3株兔源菌株2株為D型,1株為A型(結果見表1)。

2.4 定型參考菌株多重PCR結果 如圖1所示,5株定型參考菌株均擴增出了約460 bp的DNA片段 ,同時 CVCC390、391、392 、393、395 菌株還分別擴增出約 1044 bp 、760 bp、657 bp、511 bp、851 bp的DNA片段。此多重PCR結果表明,這5株定型參考菌株均為多殺性巴氏桿菌,CVCC390菌株為A型,CVCC391菌株為B型,CVCC392菌株為D型,CVCC393菌株為E型,CVCC395菌株為F型。而用此方法對支氣管敗血波氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、大腸埃希菌進行多重PCR,結果均未擴增出相應的目的片段。

圖1 定型參考菌株多重PCR結果

2.5 多重PCR的初步應用 如表1所示,利用此多重PCR方法對42株多殺性巴氏桿菌分離菌株進行擴增,結果所有菌株均擴增出了種特異片段,23株菌株擴增出了A型菌的特異片段,14株菌株擴增出了B型菌的特異片段,5株菌株擴增出了D型菌的特異片段(電泳圖略)。

2.6 多重PCR與間接血凝試驗以及Biolog結果的比較 此多重PCR方法同時可以進行種和莢膜型的鑒定,本研究利用此多重PCR方法對47株多殺性巴氏桿菌進行了種和莢膜型的鑒定,結果47株菌株均擴增出了相應的種特異性片段,此結果與Biolog鑒定結果完全一致,二者符合率為100%(CVCC477菌株未進行多重PCR擴增)。同時各菌株利用此多重PCR方法分別擴增出了相應的莢膜型特異性片段(結果見表1),這與間接血凝試驗結果完全一致,二者符合率為100%。

3 討論

多殺性巴氏桿菌廣泛分布于世界各地,可感染多種家畜、家禽、野生動物和野禽,引起發病或死亡,對我國畜牧業的發展危害嚴重。目前,被國內外學者公認的血清學鑒定方法有2種,其一是Carter G R根據莢膜抗原的不同,將多殺性巴氏桿菌分為A、B、D、E、F等5個血清群[1];其二是 Heddleston K L根據耐熱抗原的不同將多殺性巴氏桿菌分為1、2、3……16等16個血清型[5]。這些方法均存在費時、費力,敏感性較低等缺點。因此,建立特異敏感的PCR分型診斷方法是非常必要的。本研究利用6對特異引物建立了多殺性巴氏桿菌A、B、D、E、F 5型菌株和種特異的菌落多重PCR方法,并對42株多殺性巴氏桿菌進行了鑒定,同時與Carter G R間接血凝試驗方法進行比對,結果豬源菌株5株為B型,3株為A型,2株為D型;禽源菌株均為A型;牛羊源菌株均為B型;馬源菌株1株為A型,1株為B型;兔源菌株2株為D型,1株為A型。這與吳范庚等的報道一致[6]。同時此多重PCR方法與Carter G R間接血凝試驗結果二者符合率為100%。

本研究中所用的Biolog微生物自動分析系統主要是根據細菌對糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等碳源的利用情況進行鑒定。其與傳統鑒定方法相比具有操作簡便、快速、鑒定范圍廣的特點。Biolog的數據庫包括細菌、酵母和絲狀真菌在內近2000種微生物,囊括了動植物病源細菌400多種。目前本方法已成為本中心細菌鑒定常規方法[7]。本研究利用此方法和多重PCR方法進行比對,結果二者符合率為100%。

[1]Cater G R.Studies on Pasteurella multocida.I.A hemagglutination test for the identification of serological types[J].Am T Vet Res,1955,16:481-484.

[2]Townsend K M,Boyce J D,Chung J Y,et al.Genetic organization of Pasteurella multocida cap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J].Journal of Clinical Microbiology,2001,39(3):924-929.

[3]T ownsend K M,Boyce J D,Frost A J,et al.Development of PCR assays for species-and type-specific identification of Pasteurella multocida isolates[J].Journal of Clinical Microbiology,1998,36(4):1096-1100.

[4]Biolog.MicroLogTM System Release 4.2 User Guide[M].Hayward:CA,2001.

[5]Heddleston K L,Gallagher J E,Rebers P A.Fowl cholera:gel diffusion precipitin test fo r serotyping Pasteurella multocida from avian species[J].Avian Dis,1972,16:925-936.

[6]吳范庚.我國多殺性巴氏桿菌血清型綜述[J].中國獸醫雜志,1993,19(1):50-52.

[7]杜昕波,趙耘,李偉杰,等.利用BIOLOG系統對不同種類細菌鑒定的研究[J].中國獸藥雜志,2008,42(9):31-33.