靈芝孢子油檢測標準與其抗腫瘤活性的關系*

李向敏 ，謝意珍 ，2**，潘鴻輝 ，2，簡偉明 ，羅 彪 ，李森柱 ，2， 張 智 ，2

（1.廣東粵微食用菌技術有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070）

靈芝（Ganoderma lucidum）是中藥寶庫中的珍品[1]。靈芝孢子油是由靈芝孢子粉經CO2超臨界萃取而來的靈芝孢子粉中脂溶性物質，主要含有三萜類、甾醇類、脂肪及脂肪酸等成分[2，3]。功效研究表明其具有增強細胞免疫及增強NK細胞活性等降血脂[4]、免疫調節(jié)功能，并具有護肝[5]及直接抑殺腫瘤干細胞的作用[4，6]。

由于靈芝孢子油功效顯著，價格昂貴，所以市場上相關產品的質量參差不齊，嚴重影響了消費者的利益。目前，業(yè)內通常采用食用油的質量監(jiān)控指標即過氧化值、酸價作為孢子油的主要質量監(jiān)控指標。由于孢子油所含的活性物質如三萜類大部分呈酸性，并含有多種不飽和酸，這些成分都提高了孢子油的酸價，因此酸價和過氧化值作為靈芝孢子油的質量檢測指標能否體現(xiàn)產品質量就有待進一步研究。本研究中采用常規(guī)方法，如KOH標準滴定法測酸價、KI-I2法檢測過氧化值、紫外-可見光分光光度法測總三萜，此外利用腫瘤細胞檢測樣品抗腫瘤活性，主要研究靈芝孢子油質量檢測指標與其抗腫瘤活性之間的關系，為靈芝孢子油的質量檢測和標準化提供試驗依據和參數。

1 儀器與試劑

北京普析通用T6新世紀紫外-可見光光度計；Agilent LC-1200高效液相色譜儀；NIKON顯微鏡 TS100-F；Galaxy S二氧化碳培養(yǎng)箱等。

靈芝孢子油由廣東省微生物研究所廣東粵微食用菌技術有限公司提供。

齊墩果酸對照品 （批號 093K0961，sigma）； 乙腈（HPLC級，Merck公司產品）；Mill-Q超純水；其他化學試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 檢測和結果

2.1.1 酸價測定

參照GB/T 15689-1995。準確稱取3.00 g～5.00 g混勻的靈芝孢子油，置于錐形瓶中，加入50 mL中性乙醚-乙醇混合液，振搖使油溶解；冷至室溫，加入酚酞指示液2滴，以氫氧化鉀標準滴定溶液滴定，至出現(xiàn)微紅色，且0.5 min內不褪色為終點，并進行計算。

2.1.2 過氧化值測定

參照GB/T 5009.37-2003。準確稱取2.50 g混勻的靈芝孢子油，置于250 mL碘瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，振搖使油完全溶解。加入1.00 mL飽和碘化鉀溶液，緊密塞好瓶蓋，并輕輕振搖0.5 min，然后在暗處放置3 min。

取出加100 mL水，搖勻，立即用硫代硫酸鈉標準滴定溶液（0.0020 mol·L-1）滴定，至淡黃色時，加1 mL淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍色消失為終點。

取相同量三氯甲烷-冰乙酸混合液30 mL、碘化鉀溶液1 mL、水100 mL，按上述方法，做試劑空白試驗，并計算結果。

加入酚酞指示液2滴，以氫氧化鉀標準滴定溶液滴定，至出現(xiàn)微紅色，且0.5 min內不褪色為終點，并進行計算。

2.1.3 三萜含量測定

參照廣東省地標DB44。

（1）樣品處理

取靈芝孢子油0.030 g，準確至0.1 mg，置于150 mL圓底燒瓶中。加無水乙醇40 mL，70℃水浴加熱，并搖動至其完全溶解。冷卻至室溫后用無水乙醇定容至100 mL，待測。

（2）標準曲線的制作

吸取齊墩果酸儲備液（0.1 mg·mL-1）0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL于 25 mL具塞比色管中，常壓水浴蒸干溶劑。加入新配置的5%香草醛-冰乙酸0.20 mL和高氯酸0.80 mL，搖勻。70℃水浴加熱15 min，取出，冰水冷卻5 min，用自來水水浴調至室溫。用移液管準確移取冰乙酸5.00 mL稀釋，搖勻。以試劑做空白參比，在30 min內紫外可見光光度計在545 nm處測定吸光光度值y（A）。以吸光度y為縱坐標，以三萜含量（mg）為橫坐標，繪制標準曲線，求出直線回歸方程為y=0.114X+0.001，并計算相關系數為0.9988。

（3） 測定

吸取待測液1.00 mL于25 mL具塞比色管中，常壓水浴蒸干溶劑。加入新配置的5%香草醛-冰乙酸0.20 mL和高氯酸0.80 mL，搖勻。70℃水浴加熱15 min，取出，冰水冷卻5 min，用自來水水浴調至室溫。用移液管準確移取冰乙酸5.00 mL稀釋，搖勻。以試劑做空白參比，在30 min內紫外可見光光度計在545 nm處測定吸光光度值y（A）。通過線性回歸方程算得測定用的樣液中三萜類物質的質量，并依據公式計算結果。結果見表1。

（4）精密度試驗

取樣品溶液，在波長545 nm下，連續(xù)測6次，結果為吸光度平均值0.560，RSD值為0.00%，表明本方法的精密度良好。

（5）重復性試驗

取2號樣品，按照（1）和 （3）進行樣品處理和測定，平行制備6份。利用紫外-可見光分光光度計在545 nm波長處測定吸光度，計算出總三萜的含量。結果該樣品的總三萜平均含量為12.16%，RSD值為2.3%，表明本方法重復性良好，

（6）穩(wěn)定性試驗

取2號樣品，按照（1）和 （3）進行樣品處理和測定。利用紫外-可見光分光光度計在545 nm波長處測定吸光度，在1 h內每隔10 min測定1次，結果顯示吸光度的平均值為0.5545，RSD值為0.50%，表明樣品制備后在1 h內測定，穩(wěn)定性良好。

（7）回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品4（三萜含量11.20%）0.020 g至容量瓶中，加入標準溶液2 mL起，加入乙酸乙酯溶解，并定容至刻度，搖勻。按測定方法進行制備，測定吸光度，計算，結果平均回收率95%，表明本方法具有良好的回收率。

2.1.4 樣品的測定結果

以上述方法對3批樣品進行測定，結果見表1。

表1 靈芝孢子油各項指標的測定結果

樣品1～樣品6的酸價、過氧化值、總三萜情況分別如表1所示。

2.2 靈芝孢子油體外抑制腫瘤細胞的作用和實驗結果

2.2.1 樣品的制備

精確稱取樣品于無菌離心管中，用溶劑溶解樣品，配制成濃度為10%（體積比）樣品。充分溶解后，過濾，轉移至新的無菌離心管中， 然后將樣品稀釋，待用。

2.2.2 腫瘤細胞培養(yǎng)

MT-1和Jurkat細胞培養(yǎng)使用含10%滅活的胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。將密度為1×105個·mL-1處于對數生長期的腫瘤細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，試驗設對照組及不同濃度給藥組，每組設6個平行孔，5個梯度，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，細胞貼壁后，加入不同濃度樣品溶液共孵育。分別加入靈芝孢子油溶液1 μL、2 μL、3 μL、 4 μL、 5 μL，實驗對照組只加溶劑。 加入藥物后分別培養(yǎng)48 h。收集細胞，并利用細胞計數器計數，實驗重復3次。細胞存活率（P）公式為：

P=n1/n2×100%

式中：n1為實驗組n2為對照組。

2.2.3 實驗結果

靈芝孢子油對腫瘤細胞抑制作用見表2和表3。

表2 靈芝孢子油對MT-1細胞生長抑制率

表3 靈芝孢子油對Jurkat細胞生長的影響

靈芝孢子油能夠在很低濃度抑制MT-1和Jurkat細胞的生長，并且在一定濃度范圍內呈現(xiàn)濃度相關。

3 小結和討論

由試驗結果發(fā)現(xiàn)，酸價的高低與總三萜的含量和抗腫瘤作用呈現(xiàn)正相關的關系，酸價越高，總三萜的含量也越高，在很低的濃度就能達到抑制腫瘤細胞生長的效果，這一實驗結果與文獻研究是一致的[7-9]。靈芝三萜是靈芝孢子油主要活性成分，已發(fā)現(xiàn)120多種，為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜，含有多種功能基團，其中約50%的靈芝三萜類化合物為帶羧基的三萜酸，故靈芝孢子油的本身決定其酸價較高。實驗結果也證明了靈芝孢子油的酸價遠高于國家一級食用植物油的酸價指標（1.0 mg·g-1），而且酸價越高，活性越強，故酸價作為食用油的指標引入到靈芝孢子油的品質好壞的評價是不合理的。

過氧化值同樣作為食用油質量標準引入到靈芝孢子油的質量標準中。由實驗結果得出，不同樣品過氧化值的變化不明顯。

本研究旨在通過對靈芝孢子油已有質量檢測指標和活性成分進行測定，同時尋找其與抗腫瘤活性作用之間的關系，為靈芝孢子油的標準化研究提供科學依據。綜上所述，酸價作為食用油的標準引入到靈芝孢子油的質量檢測中，是不能夠體現(xiàn)靈芝孢子油質量和活性效果的，總三萜的含量高低在一定程度上能夠反應靈芝孢子油質量品質，為靈芝孢子油質量標準的研究和建立提供有效的試驗參數。

[1]鄧叔群.中國的真菌[M].北京：科學出版社，1964.

[2]王彬，周科勤，范青生，等.超臨界CO2萃取菌草靈芝孢子油中三萜類物質和脂肪酸的測定[J].食品安全與檢測，2006，22(1)：74-75.

[3]林志彬，王鵬云.靈芝孢子及其活性成分的藥理作用[J].北京大學學報，2006，38(5)：541-547.

[4]李森柱，謝意珍，周靜文，等.靈芝孢子油主要活性成分及降血脂功能的研究[J].中國食用菌，2006，25(5)：40-42.

[5]黃健康，王鳳巖，黃瓊，等.靈芝孢子油增強小鼠免疫功能及護肝作用的實驗研究[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2007，34(7)：1272-1274.

[6]Xie Yi-Zhen,Li Sen-Zhu,Albert Yee,et al.Ganoderma lucidum in hibits tumour cell proliferation and induces tumour cell death[J].Enzyme and Microbial Technology,2006(4):177-185.

[7]陳純 ，王恒邦，吳盈瑩，等.靈芝及靈芝孢子提取物的抗腫瘤及對DNA拓撲異構酶作用的研究[J].中藥藥理與臨床，2008，24(2)：45-49.

[8]林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究[M].北京：北京醫(yī)科大學出版社，2001.

[9]王江海，袁建平，徐世平，等.薄層色譜-光度法測定靈芝孢子油中的總三萜含量[J].中國食品學報，2004，4(3)：76-79.