血友病A的基因診斷研究

李茹 韓瑾 李東至 廖燦

(廣州市婦女兒童醫療中心,廣東廣州 510623)

血友病A(hemophilia A,HA)又稱甲型血友病,是最常見的1種遺傳性出血性疾病,在男性中的發病率為1/5 000～/10 000[1],約占先天性出血性疾病的85%。HA是由凝血因子VIII(F8)基因缺陷引起,導致凝血因子VIII含量不足或功能缺陷而造成凝血障礙,呈X連鎖隱性遺傳方式。根據患者血漿凝血因子VIII促凝活性及癥狀嚴重程度可分為輕、中、重3型,分別占 HA 患者的40%、10%和50%[2]。目前,HA尚無有效根治療法,開展HA攜帶者檢測和產前診斷,阻斷致病基因傳遞,防止新的HA患兒出生,是降低HA發病率的有效辦法。

為提高HA攜帶者和患者的檢出率,本研究聯合應用倒位PCR(inversion-PCR,I-PCR)、序列特異性PCR、高分辨熔解曲線分析法(high-resolution melting,HRM)、DNA測序等方法進行F8基因缺陷檢測,對所有研究對象進行了直接基因診斷,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 7例HA患者及相關家系成員(包括患者5例,其中1例患者的母親和1例患者的姐姐)和1例產前診斷樣本均由廣州市婦女兒童醫療中心遺傳咨詢門診和血液科提供。

1.2 DNA提取 患者及家系成員取靜脈血4 ml,1例產前診斷病例在孕27周時經腹穿刺抽取臍帶血2 ml,均用EDTA抗凝。DNA提取采用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,TIANGEN)。

1.3 檢測方法

1.3.1 I-PCR檢測內含子22倒位 引物設計和反應條件參照文獻[3,4],根據擴增產物的片段長度進行判斷。正常人的I-PCR產物片段為487 bp,內含子22倒位者產物片段為559 bp,倒位攜帶者產物片段為487 bp和559 bp 2條帶。

1.3.2 PCR檢測內含子1倒位 對內含子22倒位陰性者,進一步檢測內含子1倒位。按文獻[5]方法操作,分別擴增F8基因內含子1中的Int1h-1片段及F8基因外的Int1h-2片段,產物經瓊脂糖凝膠電泳后觀察電泳條帶。對int1h-1片段,若PCR產物片段長為1908 bp為正常,1323bp為倒位,攜帶者有此2條帶;對int1h-2片段,若產物片段長為1191 bp為正常,1776 bp為倒位,攜帶者有此2條帶。

1.3.3 HRM和DNA測序檢測點突變 對內含子22和1倒位陰性者,首先將男性患者的DNA與正常男性的DNA以1:1比例混合,引物設計和反應條件參照文獻[6,7],PCR擴增F8基因所有外顯子及外顯子-內含子交界區,然后應用高分辨熔解曲線分析儀LightScanner進行突變掃描,對篩查陽性片段進一步作測序分析確定致病突變。

2 結果

2.1 F8基因內含子22倒位 4例HA患者擴增得到559 bp的片段,為第22內含子倒位者,這其中1位患者的母親擴增得到487 bp和559 bp2個片段,為倒位攜帶者。結果見圖1。此倒位攜帶者母親于孕27周抽取臍帶血進行產前診斷,胎兒性別為男性,I-PCR擴增產物片段為559 bp,診斷為HA患者。余1例HA患者及其姐姐未檢出內含子22倒位。

圖1 I-PCR檢測內含子22倒位電泳結果

2.2F8基因內含子1倒位 對未檢出內含子22倒位的HA患者及其姐姐進行內含子1倒位檢測。對int1h-1片段,PCR產物片段長1 908 bp,為正常;對int1h-2片段,PCR產物片段長為1 191 bp,為正常。因此排除內含子1倒位突變。結果見圖2。

圖2 PCR檢測內含子1倒位電泳結果

2.3F8基因點突變 對上述內含子22和1倒位陰性的HA患者,采用HRM 進行突變掃描,結果顯示第8外顯子存在異常熔解曲線(圖3),經直接測序分析鑒定為第329位密碼子錯義突變 TGT→TAT(圖4),即 c.986G ＞A(p.Cys329Tyr)。此突變已在HAMSTeRS數據庫有報導。該患者姐姐經檢測確診為此錯義突變攜帶者(圖4)。

圖3 F8基因第8外顯子HRM突變篩查結果

3 討論

F8基因位于Xq28,大小約 186 kb,由26個外顯子和25個內含子組成,mRNA大小約9kb,基因結構龐大。已知重型患者中近50%為內含子22的倒位突變[8],近年來發現內含子1倒位是僅次于內含子22倒位導致重型HA的常見原因[5,9]。除此之外,大部分患者則多為點突變,目前已知有797種(HAMSTeRS數據庫),且無突變熱點,多數散亂。

圖4 F8基因第8外顯子測序圖部分序列

隨著對血友病A分子基礎的認識不斷深入,該病的基因診斷技術也得到很大發展。F8基因突變的診斷方法主要分為2類:直接基因診斷和間接基因診斷。

血友病 A的直接基因診斷技術主要包括Southern 雜交、LD-PCR(long-distance PCR)、SSCP(single strand conformation polymorphism)、DGGE(denatured gradient gel electrophoresis)及DHPLC(denatured high performance liquid chromatography)等。對于最常見的內含子22倒位突變目前大多采用LD-PCR進行檢測[10]。但 LDPCR專用酶及deaza-dGTP等的試劑價格昂貴,成本較高。近期出現的1種新技術即I-PCR,也用于檢測第22內含子倒位,與LD-PCR相比,由于擴增產物片段較短,大大減小了擴增難度,而且該方法對DNA樣本的要求較低[11]。其他突變種類則多為點突變,一般先采用SSCP、DGGE或DHPLC的方法篩查突變,然后經測序明確致病突變。

本研究采用I-PCR進行第22內含子倒位患者及攜帶者的檢測,并成功完成了1例產前基因診斷。F8基因的突變篩查則采用HRM技術。HRM是近年來發展的1種用于突變掃描和基因分型的最新遺傳學分析方法。它是1種高效穩健的post-PCR技術,不受突變堿基位點與類型的局限,無需序列特異性標記探針,PCR結束后直接運行熔解曲線分析,5分鐘即可完成對樣品的結果分析。這種方法因其操作簡便快捷、成本低廉、結果準確,且可實現高通量(96或384孔板),因此尤其適用于測序前的大規模突變篩查,是1種高靈敏度高特異性的核酸突變篩查技術。本研究通過采用LightScanner進行HRM分析,可在2小時內(包括PCR反應和HRM分析)完成對F8基因全部26個外顯子的突變篩查,且單孔單樣本的檢測成本僅為2.5元。篩查結果顯示1例HA患者第8外顯子存在異常熔解曲線,經測序確定為c.986G＞A(p.Cys329Tyr)錯義突變。致病突變和多態性位點都可以導致異常熔解曲線,因此應用HRM篩查得到異常熔解曲線時,須經測序以確定所檢測到SNP(single nucleotide polymorphism)的性質。對于已知的SNP,可在數據庫中檢索以明確其性質;對于新發突變,還需在正常對照人群(家系中正常人及無血緣關系健康人)中作進一步篩查以確定其致病性。

血友病A的間接基因診斷即為家系連鎖分析,主要依靠 RFLP(restrictionfragment length polymorphism)、STR(shorttandem repeat)、VNT R(variable number of tandem repeats)等多態性標記與致病突變等位基因的連鎖關系及其向后代的傳遞情況進行診斷[12,13]。然而間接基因診斷存在顯著局限性,如不能明確突變性質,可因基因內重組的發生而導致誤診,或家系成員無法提供多態信息等使診斷受到限制,對于新發、散在病例更無法診斷。

總的來說,由于現有技術的局限性,加上基因突變的多樣性,部分家系在目前的條件下尚無法做出判斷。特別是對于新突變造成的散發性血友病家系,診斷率更低。因此,HA的基因診斷不能只單獨依靠1項檢測手段。本研究即聯合應用I-PCR、序列特異PCR、HRM、DNA測序技術實現了對所有研究對象的直接基因診斷。在臨床實踐中對于有先證者的家系,應首先對先證者依次進行以下檢測:①采用I-PCR檢測內含子22倒位;②排除內含子22倒位后,采用序列特異PCR檢測內含子1倒位;③若排除以上2種倒位突變,則應用HRM進行點突變篩查,然后測序確定致病突變。在明確先證者致病突變后,再進一步對家系中其他患者和可能攜帶者進行檢測。本研究所提出的HA的直接基因診斷策略,簡便快捷、經濟有效,可進一步提高現有診斷的有效率和準確性,在HA的基因診斷及產前診斷中具有較強的實用性,適于在臨床推廣應用。今后將進一步提高樣本量來進行實踐驗證,逐步建立起一套完善的直接基因診斷體系,以提高血友病A的診斷率,并豐富中國人群血友病A的基因突變譜。

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