腦紅蛋白與 Caspase-3在大鼠海馬CA1區的相關性

,,,

(遵義醫學院第五附屬(珠海)醫院,廣東珠海 519100)

2000年 Burmester等[1]首次報道人和小鼠大腦神經元中存在腦紅蛋白(NGB)。NGB在缺氧狀態下能夠特異性地向腦組織供氧,促進神經系統氧攝取、氧運輸和氧利用等[2]。Caspase-3[3]是 Caspase家族中最關鍵的凋亡蛋白酶,在各種因素啟動的凋亡程序中起最后的樞紐作用。2008年 9月～2010年 1月,本研究采用免疫組化法與原位雜交法對大鼠大腦海馬 CA1區的 NGB與 Caspase-3表達變化來探討 NGB與 Caspase-3在腦缺血再灌注損傷的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠與分組 健康 SD大鼠 60只,由遵義醫學院珠海校區實驗動物中心提供,體質量 250～350 g。隨機分為對照組和實驗組,各 30只,每組按再灌注的時間(3、6、12、24、48 h)又分為共 5個觀察時間點,每個時間點 6只大鼠。

1.2 試劑 兔抗大鼠 NGB多克隆抗體(濃縮型),兔抗大鼠 Caspase-3多克隆抗體(即用型),Caspase-3mRNA原位雜交試劑盒,原位雜交專用 PBS緩沖液,TBS緩沖液,2×SSC緩沖液均由武漢博士德提供。NGBmRNA原位雜交試劑盒由上海和樂生物科技有限公司提供。

1.3 模型制作 采用 Pulsinelli-Brierley四血管阻塞法建立急性全腦缺血再灌注損傷模型。大鼠稱重后以5%異戊巴比妥鈉按 100mg/kg麻醉,枕下至第五頸椎正中縱行剪開皮膚,止血鉗鈍性分離暴露雙側橫突孔,電凝雙側椎動脈,24 h后分離雙側頸總動脈,用無損傷動脈夾夾閉雙側頸總動脈,大鼠的角膜反射、翻正反射消失、眼球 2～3 s即變灰、毛發可豎起,15min后撤去無損傷動脈夾造成再灌注;對照組只暴露橫突孔,不阻塞椎動脈;只分離頸總動脈,不夾閉。實驗中有翻正反射、一直抽搐、能吸水者、眼球不變灰者棄之。

1.4 檢測方法 兩組分別在缺血再灌注后 3、6、12、24、48 h斷頭取腦,放入 4%的多聚甲醛液中固定、蠟塊包埋、切片、烤片,免疫組化按 SABC法進行檢測,原位雜交按其說明書進行操作。成片Leica DM LB2光學顯微鏡下觀察,通過 IBM攝像系統,運用 Viewfinder拍照、采圖軟件進行采圖保存。采用 Image Pro Plus6.0圖像分析系統對所采圖象進行光密度值測量。存活神經元數目采用HE染色,光鏡下用尺型計數器計數海馬區0.5mm存活的神經元數目,光鏡倍數為 10×40。

1.5 統計學方法 采用 SPSS 16.0統計軟件,結果以±s表示,各組內比較采用單因素方差分析并用 q檢驗進行兩兩比較,兩組間各時間點單獨比較采用獨立樣本 t檢驗,各組間用 Spearman法進行相關性分析,以 P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色后大鼠大腦海馬 CA1區存活錐體細胞數的變化見表1。

2.2 各組大鼠大腦海馬 CA1區 NGB與 Caspase-3表達的光密度值及其相關性 見表2。實驗組海馬 CA1區 NGB與 Caspase-3呈負相關(r=-0.798,P=0.00)。

2.3 各組大鼠大腦海馬 CA1區 NGBmRNA與Caspase-3mRNA表達的光密度值及其相關性 見表 3。實驗組海馬 CA1區 NGBmRNA與 Caspase-3 mRNA呈負相關(r=-0.854,P=0.00)。

表1 再灌注后海馬 CA 1區存活錐體細胞數(個/mm,±s)

表1 再灌注后海馬 CA 1區存活錐體細胞數(個/mm,±s)

注:與對照組比較,*P＜0.01

組別 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h對照組 83.83±3.66 82.17±2.23 83.16±2.32 84.00±3.58 83.29±2.53實驗組 62.39±2.86 42.83±4.36* 34.00±4.10* 17.83±2.64* 5.00±1.41*

表2 再灌注后海馬 CA 1區細胞中 NGB與 Caspase-3表達的光密度值(±s)

表2 再灌注后海馬 CA 1區細胞中 NGB與 Caspase-3表達的光密度值(±s)

注:與對照組比較,*P＜0.05,△P＜0.01

組別 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h對照組NGB 0.148±0.012 0.15±0.008 0.143±0.013 0.149±0.011 0.153±0.007 Caspase-3 0.079±0.003 0.081±0.004 0.082±0.006 0.080±0.003 0.081±0.006實驗組NGB 0.150±0.001 0.146±0.005 0.124±0.002* 0.105±0.003△ 0.085±0.001△Caspase-3 0.083±0.008 0.113±0.005△ 0.136±0.005△ 0.168±0.007△ 0.147±0.005△

表3 再灌注后海馬CA 1區細胞中 NGB mRNA與 Caspase-3mRNA表達的光密度值(±s)

表3 再灌注后海馬CA 1區細胞中 NGB mRNA與 Caspase-3mRNA表達的光密度值(±s)

注:與對照組比較,*P＜0.05,△P＜0.01

組別 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h對照組NGBmRNA 0.094±0.006 0.093±0.005 0.093±0.001 0.092±0.007 0.090±0.003 Caspase-3 mRNA 0.089±0.002 0.090±0.003 0.090±0.004 0.088±0.006 0.089±0.004實驗組NGBmRNA 0.095±0.004 0.091±0.002 0.073±0.008* 0.049±0.005△ 0.042±0.002△Caspase-3 mRNA 0.091±0.004 0.142±0.018△ 0.171±0.007△ 0.207±0.008△ 0.189±0.005△

3 討論

腦缺血再灌注損傷是腦缺血難以避免的損傷過程。NGB與Caspase-3是腦缺血損傷過程中表達明確的對立因素[4,5]。但其對立性是通過何種途徑及其哪些因素參與損傷的過程目前研究不是很明確。本實驗從基因與蛋白角度分別從多個時間點觀測 NGB與Caspase-3表達變化,表明兩者之間的相互制約性,但在時間上波動性的具體機制不是很明了。缺氧耐受因子-1a(HIF-1α)[6]是一種對低氧敏感性因子,在缺氧狀態下表達量有迅速、短暫的升高,缺氧激活后通過啟動下游低氧反應元件參與組織的保護。研究[7]認為 NGB可能是其下游反應基因表達的產物;但同時大量研究發現在嚴重缺氧或持續缺氧的組織中 HIF-1α可以促進細胞的凋亡,可能與 HIF-1α聚集 P53的表達所致。P53作為轉錄因子可以誘導一系列下游基因的表達,介導細胞停止在 G1期,使受損的 DNA有足夠時間得到修復,如果修復失敗,則啟動凋亡程序,通過降低細胞內源性 Bcl-2,提高細胞內 Bax蛋白的表達,激活Caspase-3等發揮促凋亡的作用。陳婷芳等論證了NGB啟動區存在 P53結合位點,P53具有增強 NGB的轉錄功能。因此組織細胞在缺血凋亡中的動態演變應該是失衡—修復—凋亡;這與實驗數據在時間上差異性表達趨于一致。海馬 CA1區是缺血敏感區,神經元抵御缺氧能力最低,缺血缺氧誘導一系列抗損傷因子(HIF-1α、P53等)的表達同時也潛伏了凋亡因子的轉錄。此外,NGB與Caspase-3之間的負相關關系實際上是一種時間上的輪替關系,為臨床早期干預缺血后的再灌注損傷提供了依據。

可見,大鼠全腦缺血再灌注后,海馬區 NGB的表達有助于神經元功能的恢復,并隨時間呈遞減性表達,且與 Caspase-3呈負相關關系。

[1]Burmester T,Weich B,Reinhardt S,etal.A vertebrate globin expressed in the brain[J].Nature,2000,407(6803):520-523.

[2]Khan AA,Mao XO,Banwait S,et al.Regulation of hypoxic neuronal death signaling by neuroglobin[J].FASEB J,2008,22(6):1737-1747.

[3]Tanaka H,Yokota H,Jover T,et al.Ischemic preconditioning:neuronal survival in the face of caspase-3 activation[J].JNeurosci,2004,24(11):2750-2759.

[4]Sun Y,Jin K,Mao XO,et al.Neuroglobin is up-regulated by and protectsneurons fromhyp oxic-ische micinjury[J].Proc Natl Acad Sci U SA,2001,98(26):15306-15311.

[5]陳浩,臧賀川,伊紅麗,等.一氧化碳中毒大鼠腦紅蛋白表達變化及對半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3表達的影響[J].中國臨床康復,2006,10(2):73-76.

[6]李佩堯,張成崗.細胞內低氧感受器:缺氧誘導因子-1脯氨酰羥化酶研究進展[J].生理科學進展,2007,38(1):62-64.

[7]Zhang C,WangC,Deng M,et al.Full-length cDNA cloning of human neuroglobin and tissue expression of rat neuroglobin[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,290(5):1411-1419.