染料木素對心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究

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(贛南醫學院,江西贛州 341000)

染料木素(Gen)為異黃酮的一種,被認為在女性心血管疾病、乳腺癌、更年期潮熱、絕經后骨質疏松的預防和治療中具有重要作用。此外,還具有抗氧化、抗衰老、抗真菌、抑制真菌活性及酪氨酸蛋白激酶活性的功能[1]。2009年 1～7月,我們針對Gen對心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 動物 SD大鼠 40只,體質量(220±20)g,雌雄各半,由江西中醫學院實驗動物中心提供。

1.2 試劑與儀器 Gen由沈陽藥科大學植化室提供,純度 99%,注射用水 +二甲基亞砜(DMSO)(7:3)配成所需濃度;乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。BL-420S生物機能實驗系統為成都泰盟儀器有限公司生產。AG135型光電天平,中佳 KLC-2046型低速冷凍離心機,721-分光光度計為上海精密科學儀器有限公司生產。

1.3 動物模型的建立及分組[2]將 40只 SD大鼠腹腔注射烏拉坦(1.2 g/kg),麻醉后記錄Ⅱ導聯心電圖(ECG),氣管插管,在左側第 3～4肋間開胸,剪開心包,暴露心臟,于肺動脈圓錐與左心房中間找出冠狀動脈左前降支,并用圓形無創縫合針 6/0絲線置于左冠狀動脈前降支起始部下 2mm處備用。將手術后的大鼠隨機分為 5組,分別為缺血模型組、陰性對照組、Gen高劑量組(10mg/kg)、Gen中劑量組(5mg/kg)、Gen低劑量組(2.5 mg/kg)。除陰性對照組僅穿線不結扎外,其余各組均以 0號線立即結扎。結扎冠狀動脈,以 ECGⅡ導聯 ST段抬高 0.1 mV或 T波高聳、心肌顏色變暗紅色為結扎成功的標志。于結扎冠狀動脈左前降支后第 10分鐘經舌下靜脈注射各濃度 Gen溶液,模型組及陰性對照組經舌下靜脈注入等體積溶劑,結扎 40min后恢復供血 60min造成在體缺血再灌注。

1.4 Ⅱ導聯 ECG T波幅度變化值 造模成功后記錄全程Ⅱ導聯 ECG,觀察實驗各組結扎前后 0、1、5、10、20、30 min T波幅度值。

1.5 生化指標檢測 實驗結束后,左心室心內穿刺取血,分離血清測定血清中 LDH、CK、MDA、SOD值。操作步驟按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行。

1.6 免疫組化染色 Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體為北京中山生物技術公司產品。取上述石蠟標本相應部位的連續切片各 3張,常規脫蠟至水,以 Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體為一抗進行免疫組化 SP染色,按說明書操作。DAB顯色,蘇木精對比染色,中性樹膠封片鏡檢。以細胞核染成棕色的細胞為陽性細胞,根據陽性細胞分布情況,在 40×高倍鏡視野下,每張切片隨機選擇 10個視野,每個視野計數 100個細胞。計算平均陽性細胞率(陽性細胞數/計數細胞總數 ×100%)作為陽性細胞表達指數(PEI)。

1.7 統計學方法 采用 Prism 4.0統計軟件處理實驗數據,兩樣本均數比較用 t檢驗,兩組樣本率比較用Fishers確切概率法,以 P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Gen對心肌缺血 T波幅度值變化的影響 見表1。

2.2 Gen對心肌缺血再灌注損傷后血清中各生化指標含量的影響 見表2。

3.3 Gen對凋亡相關蛋白 Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響 見表3。

表1 Gen對心肌缺血 T波幅度值變化的影響(mV,±s)

表1 Gen對心肌缺血 T波幅度值變化的影響(mV,±s)

注:與模型組比較,*P＜0.05,△P＜0.01

組別 0m in 1min 5min 10m in 20min 30m in模型組 0.27±0.08 0.46±0.09 0.47±0.07 0.50±0.11 0.43±0.04 0.46±0.10陰性對照組 0.21±0.06 0.22±0.09△ 0.22±0.09△ 0.24±0.05△ 0.23±0.07△ 0.24±0.08△Gen高劑量組 0.24±0.06 0.44±0.12 0.58±0.08 0.23±0.07△ 0.24±0.09△ 0.26±0.06△Gen中劑量組 0.26±0.06 0.36±0.10 0.53±0.05 0.31±0.07* 0.23±0.10△ 0.32±0.04 Gen低劑量組 0.24±0.07 0.35±0.09 0.52±0.13 0.31±0.06* 0.33±0.09 0.37±0.07

表2 Gen對心肌缺血再灌注損傷后血清中各生化指標含量的影響(±s)

表2 Gen對心肌缺血再灌注損傷后血清中各生化指標含量的影響(±s)

注:與模型組比較,*P＜0.05;與陰性對照組比較,△P＜0.05

組別 LDH含量(U/L) CK含量(U/L) MDA含量(nmol/ml) SOD含量(U/m l)模型組 1631.57±440.79△ 1301.71±790.86△ 9.23±0.45△ 295.25±28.60△陰性對照組 792.12±187.68 533.62±103.25 5.36±1.05 348.67±34.39 Gen高劑量組 829.62±422.83* 518.75±274.77* 5.44±0.27* 341.51±41.64*Gen中劑量組 984.28±327.29* 812.57±278.00* 6.97±1.25* 329.54±36.18*Gen低劑量組 1502.00±454.06△ 1236.69±523.84△ 6.75±1.85* 310.63±34.40

表3 Gen對凋亡相關蛋白 Bcl-2、bax、caspase-3表達的影響(±s)

表3 Gen對凋亡相關蛋白 Bcl-2、bax、caspase-3表達的影響(±s)

注:與模型組比較,*P＜0.05,△P＜0.01;與陰性對照組比較,#P＜0.01

組別 Caspase-3 Bax Bcl-2模型組 65.3±13.1# 57.6±8.9# 17.9±6.2陰性對照組 10.1±3.5△ 7.6±2.1△ 23.7±4.5 Gen高劑量組 20.5±2.3△ 16.3±5.1△ 38.1±6.3*Gen中劑量組 28.7±4.6△ 20.7±3.5△ 39.2±5.3*Gen低劑量組 45.7±1.5* 38.6±5.3* 36.7±2.5*

3 討論

大量研究表明,心肌缺血一定時間后恢復灌注,氧自由基含量突然明顯增加,內源性抗氧化酶系統活性降低,其中以SOD活性降低最為明顯[3]。氧自由基的增加主要與再灌注時黃嘌呤氧化酶的激活、中性粒細胞呼吸爆發、呼吸鏈電子傳遞障礙以及兒茶酚胺釋放增多等因素有關。因抗氧化酶系統活性下降,無法清除過多的氧自由基,從而引發強烈的脂質過氧化反應,破壞脂質細胞膜,導致組織細胞的損傷[4]。Caspase-3可導致細胞內重要蛋白質降解失活及DNA斷裂,是細胞凋亡的主要效應因子[5]。Bcl-2家族是一類主要的凋亡調控基因,包括 Bcl-2、Bax等,Bcl-2促進細胞生存,抑制細胞凋亡,而 Bax促進細胞凋亡[6]。

本研究表明,Gen對缺血再灌注心肌具有明顯的保護作用,Gen能明顯降低血清中 LDH和 CK活性,LDH和CK活性常用來反映心肌受損的程度,說明Gen能降低心肌的損害程度。而心肌缺血再灌注損傷時,氧自由基大量生成,且對自由基的清除能力也大大降低,從而造成大量自由基蓄積,引起心肌組織的嚴重損傷。Gen能降低心肌缺血再灌注損傷大鼠血清 MDA含量,升高 SOD活性,提示 Gen可能是通過抑制脂質過氧化酶,抑制脂質過氧過程,并同時提高內源性抗氧化酶活性而減輕氧自由基對心肌的損傷。Gen能使缺血再灌注后的心肌組織中 Bcl-2蛋白表達增加,而 Bax、Caspase-3蛋白表達降低,說明 Gen減少心肌細胞凋亡的機制可能與調節凋亡的相關基因Bcl-2、Bax、和 Caspase-3蛋白表達有關。

[1]余燕影,胡昕,曹樹穩,等.染料木素 7,4-二-β-D-吡喃葡萄糖苷的合成[J].化學研究與應用,2007,19(3):323-326.

[2]朱志軍,劉偉華,王俊科.芬太尼、脂多糖預處理對缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護作用及機制探討[J].山東醫藥,2007,47(18):18-19.

[3]郭來敬,張志仁,陳東輝,等.電子順磁共振檢測心肌缺血再灌產生的氧自由基及其保護的實驗研究[J].心肺血管病雜志,2000,19(1):58-60.

[4]Mair P,Mair J,Bleier J,et al.Reperfusion after cardioplegic cardiac arrest--effects on intracoronary leucocyte elastase release and oxygen free radical mediated lipid peroxidation[J].Acta Anaesthesiol Scand,1995,39(7):960-964.

[5]Crow MT,Mani K,Nam YJ,et al.The mitochondrial death pathway and cardiacmyocyte apoptosis[J].Circ Res,2004,95(10):957-970.

[6]童曉紅,丁家望,楊俊,等.蛋白酶激活受體-2對心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].山東醫藥,2009,49(20):37-38.