冰凍切片技術(shù)聯(lián)合免疫組織化學(xué)在胸腹水細(xì)胞診斷中的應(yīng)用研究

蔡暉滔

胸腹水是臨床上多種疾病，特別是腫瘤性疾病的常見(jiàn)伴發(fā)體征，臨床上胸腹水的性質(zhì)對(duì)于疾病的診斷有較大的價(jià)值，常將胸腹水送病理檢查。一般病理檢查通常離心、涂片、HE染色進(jìn)行病理診斷，但由于細(xì)胞分散、染色效果不好、重復(fù)性差等原因，診斷的陽(yáng)性率較低，易漏診。尤其是增生的間皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性腺癌；未分化癌與小細(xì)胞癌和淋巴瘤之間不易區(qū)別，疑診病例較多，對(duì)臨床幫助不太大[1]。我們將胸腹水離心進(jìn)行冰凍切片常規(guī)HE染色，同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)免疫組織化學(xué)標(biāo)記，明顯提高了胸腹水細(xì)胞診斷的陽(yáng)性率及準(zhǔn)確性。該方法可重復(fù)性高，細(xì)胞清晰，能明確診斷，部分病例能明確腫瘤的類(lèi)別和來(lái)源，有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

我們從2006年5月至2007年12月共收集我院胸腹水標(biāo)本64例，其中胸水44例、腹水20例，男性38例、女性36例，年齡35～86歲，平均年齡52歲。

1.2 方法

1.2.1 將送檢的胸腹水直接用一次性吸管吸取下面沉淀的部分30mL于試管內(nèi)、離心10min，2500r/min。將上清液去掉，離心沉淀物涂片1張、HE染色。沉淀的部分放在冰凍切片機(jī)的冷凍頭上，然后加人OCT包埋劑進(jìn)行切片。

1.2.2 胸腹水離心沉淀物少就直接倒去上清液，先在冰凍切片機(jī)的冷凍頭上加人OCT包埋劑，然后將胸腹水離心沉淀物放在上面進(jìn)行切片。

1.2.3 胸腹水離心沉淀物常規(guī)切片6張：1張HE染色、5張免疫組織化學(xué)染色。

1.2.4 制作免疫組織化學(xué)染色的冰凍切片必在冷藏保存，然后根據(jù)需要進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)我們標(biāo)記的CK、EMA、LCA、間皮細(xì)胞、Vimentine。免疫組織化學(xué)染色方法：采用即用型快捷免疫組織化學(xué)MaxvislonTm試劑盒，試劑及抗體和免疫組織化學(xué)陽(yáng)性片由福建邁新生物技術(shù)公司提供，陰性對(duì)照采用PBS作為一抗。

其染色步驟如下：①切片實(shí)溫干燥后，入4℃丙酮固定10min，用PBS（pH：7.4）沖洗3次，每次3min（3×3）。②根據(jù)每一種抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)，除細(xì)胞角蛋白用胰酶消化外，間皮細(xì)胞、Vimentin、LCA、EMA都要檸檬酸高溫修復(fù)（按說(shuō)明操作）。③每張切片加1滴3%過(guò)氧化氫，室溫下孵育10minPBS洗（3×3）。④每張切片加1滴自選1抗體，室溫下孵育60min。⑤PBS沖洗3×3，除去PBS液每張切片加1滴即用型試劑，室溫下孵育10分鐘，PBS洗3×3。⑥除去PBS液，每張切片加2滴新配制的DAB溶液10min。⑦自來(lái)水洗，蘇木素復(fù)染直致中性樹(shù)膠封固。

2 結(jié) 果

送檢的64例胸腹水直接離心涂片HE染色診斷陽(yáng)性細(xì)胞7例，陰性40例，可疑陽(yáng)性18例。應(yīng)用冰凍切片技術(shù)聯(lián)合免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果陽(yáng)性細(xì)胞24例，陰性38例。可疑陽(yáng)性?xún)H2例，見(jiàn)表1和表2。

表1 64例胸腹水單純涂片與冰凍切片HE片診斷結(jié)果

表2 64例胸腹水冰凍切片切片免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果

3 討 論

胸腹水是臨床上多種疾病的首發(fā)體征，正確診斷明確胸腹水性質(zhì)對(duì)正確治療有重要意義。臨床上常將送檢的胸腹水單純離心涂片HE染色光鏡下病理診斷，但由于細(xì)胞分散、染色效果不理想，又因細(xì)胞容易堆積成團(tuán)，難以明顯診斷，其診斷的陽(yáng)性率較低，特別是小細(xì)胞腫瘤難以和間皮瘤、淋巴瘤、未分化腫瘤細(xì)胞之間難以區(qū)別，給診斷帶來(lái)困難。我們采用冰凍切片技術(shù)聯(lián)合免疫組織化學(xué)在胸腹水細(xì)胞診斷中的應(yīng)用，明顯提高了陽(yáng)性細(xì)胞的檢出率，由于冰凍切片技術(shù)是將胸腹水離心、加入OCT后常規(guī)冰凍切片、HE染色，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚、重復(fù)性好，還可作免疫組織化學(xué)標(biāo)記、大大提高了胸腹水細(xì)胞診斷的準(zhǔn)確性，免疫組織化學(xué)標(biāo)記又能準(zhǔn)確的定位腫瘤細(xì)胞的表達(dá)的抗原，確定腫瘤細(xì)胞屬性及來(lái)源，特別是對(duì)分化差的腫瘤的病理診斷或腫瘤類(lèi)型的確定中起到重要的鑒別作用，在難病例中診斷中，對(duì)明確腫瘤類(lèi)型起著重要的指導(dǎo)意義。不僅有助于良、惡性的判斷而且對(duì)常規(guī)涂片中難以鑒別的間皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性腺癌的識(shí)別有重要的參考作用[2]。

同時(shí)免疫組織化學(xué)在鑒別間皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)移腺癌時(shí)，因?yàn)殚g皮細(xì)胞具有雙向分化的特點(diǎn)，因此上皮性抗原不標(biāo)記（EMA）但間葉性標(biāo)記vimentin有不同程度的陽(yáng)性，而癌細(xì)胞則呈單一性上皮抗原陽(yáng)性，vimentin常為陰性。間皮細(xì)胞：主要分布在間皮細(xì)胞中，其他腺上皮一般不表達(dá)，主要用于惡性間皮瘤的的診斷，在鑒別診斷時(shí)，惡性間皮瘤的陽(yáng)性部位應(yīng)為細(xì)胞膜，而其他腺癌多為胞漿陽(yáng)性，在觀察時(shí)應(yīng)注意，Vimentin：作為一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照是很好的標(biāo)記物，在非腫瘤性上皮組織中很容易表達(dá)作為內(nèi)對(duì)照。EMA：上皮膜抗原對(duì)內(nèi)臟腺上皮的表達(dá)優(yōu)于細(xì)胞角蛋白，因此，對(duì)上皮源性腫瘤，尤其是低分化癌最好細(xì)胞易角蛋白聯(lián)合應(yīng)用。CK：細(xì)胞角蛋白用于鱗癌、腺癌、小細(xì)胞癌、惡性間皮瘤部分滑膜肉瘤，平滑肌肉瘤，可疑陽(yáng)性抗原，在鑒別診斷中EMA進(jìn)行上皮性腫瘤與非上皮性腫瘤的鑒別。LCA主要用于淋巴瘤與未分化小細(xì)胞癌的鑒別[3]。因此，冰凍切片技術(shù)及免疫組織化學(xué)聯(lián)合檢測(cè)胸腹水細(xì)胞有重要的應(yīng)用價(jià)值。

但在操作中值得注意的幾個(gè)問(wèn)題：①冰凍切片不能太厚，一般4μm連續(xù)切片，同時(shí)應(yīng)使用粘膠片，切片后如果不染色，必須吹干，冷藏保存。②在胸腹水細(xì)胞離心沉淀少的情況下，倒去上清應(yīng)該先在冷凍頭上放OCT然后再將胸腹水細(xì)胞離心沉淀物放在上面切片。③如果血性胸腹水，可加入0.5%氯化氨溶液離心去除紅細(xì)胞效果比較好。④在采集胸腹水時(shí)最好使用一次性吸管吸取下面沉淀部分，胸腹水應(yīng)新鮮。⑤免疫組織化學(xué)觀察時(shí)應(yīng)注意，胞漿和細(xì)胞核陽(yáng)性的差異，特別是惡性間皮瘤陽(yáng)性部位在胞膜部分，免疫組織化學(xué)還可根據(jù)病例不同選擇相宜的抗體。

[1]劉夢(mèng)海,梁忠泉,袁昌隆,等.痰液和胸腹水沉積物切片在腫瘤脫落細(xì)胞中的應(yīng)用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2003,19(4):409.

[2]丁華新,何向蕾,陳培輝.免疫細(xì)胞化學(xué)在胸腹水細(xì)胞學(xué)鑒別診斷中的應(yīng)用[J].臨床病理學(xué)雜志,2002,99 (4) :220 .

[3]羅慶豐,謝梅,高玟,等.冰凍切片及免疫組織化學(xué)技術(shù)在胸腹水細(xì)胞診斷中的應(yīng)用[J].實(shí)用癌癥雜志,2007,22(4):363.