抗纖復方含藥血清對HSC-LI90細胞Ⅰ型、Ⅳ型前膠原、基質金屬蛋白酶組織抑制因子1 mRNA表達影響的研究

李 晶 趙 鋼

抗纖復方是臨床治療肝纖維化的有效藥物，由黃芪、丹參、紫河車、郁金等藥物組成[1]。以往的實驗研究表明，該藥不僅能夠抑制肝內多種細胞外基質的合成，而且能夠抑制肝纖維化大鼠肝星形細胞TGFβ1的表達，減少膠原產生[2，3]。我們為了研究該復合方劑抗肝纖維化作用機制，以不同劑量抗纖復方含藥血清進行實驗室研究，以Northern 印跡雜交方法進一步觀察抗纖復方對HSC-LI90細胞I型（CoL-I）、IV型前膠原（CoL-IV）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 抗纖復方的制備

其無菌制劑由上海曙光醫院制劑中心制備，以蒸餾水分別稀釋成0.025、0.05、0.10、0.3g/mL等不同濃度。

1.2 細胞系

星形細胞系HSC-LI90由日本佐賀醫科大學肝病中心惠贈，系表型為活化的人肝星形細胞（HSC），表達高水平的CoL-I、MMP-II、TIMP-l、TGFβ1mRNA等[4]。

1.3 動物

用于制備含藥血清的大鼠，清潔級，雌雄各半，體質量300～350g，購自上海中醫藥大學實驗動物中心。

1.4 抗纖復方含藥血清的制備

大鼠隨機分為5組，每組5只，其中4組按體質量灌胃給予抗纖復方水溶液1.0mL/100g體質量，2次/d，劑量依次為0．5、2.0體質量、4.0g/kg體質量，于給藥后90min分別以1.5%的苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉，無菌條件下，從腹主動脈采血約10mL，存放于4℃冰箱中，待血漿凝固血清析出后，于高速離心機中以3000rpm離心10min，留取血清。另設一組作為空白對照組。所有血清均經56℃、30min滅活后，置-20%冰箱中保存備用。

1.5 細胞培養

HSC-LI90細胞以1×106細胞/100mm的濃度接種于培養皿，24h后，分別加入10%抗纖復方含藥血清10mL，同時設空白對照組。培養48h后，提取細胞總RNA，檢測HSC-LI90細胞I型、IV型前膠原、TIMP-1mRNA表達。

1.6 CoL-I 、CoL-IV 、TIMP-1 mRNA的Northern印跡雜交

運用AGPC法，從HSC-LI90細胞中提取總RNA。每20μg總RNA加入1%瓊脂糖凝膠中，電泳后，將變性的RNA轉移至硝酸纖維素濾膜（AmershamJapan）然后用32P-dCTP標記的cDNA探針與之雜交16h，雜交濃度65℃，洗膜2次以后，放射自顯影。定量用BAS2000測定分析。用CoL-I（CoL-III、TIMP-1）/GAPDH的比值表示CoL-I、CoL-III、TIMP-1表達水平。每項實驗至少重復3次，數據用mean±SD表示，用單因素方差分析進行統計學處理。

2 結 果

不同濃度的抗纖復方含藥血清均有降低CoL-I、CoL-IV、TIMP-1 mRNA水平的作用，并呈一定劑量依存關系，統計學處理P＜0.05或0.01，結果見圖1。

圖1 抗纖復方含藥血清CoL-I、CoL-IV 、TIMP-1 mRNA的影響

3 討 論

肝纖維化為諸多慢性肝病發展至肝硬化過程中所共有的病理組織學變化，是影響肝病預后的重要環節，在尚無有效方法根治原發疾病的情況下，減緩或阻止肝纖維化的進程，是相當重要的治療對策。 肝纖維化、肝硬化的病理基礎是細胞外基質在肝臟異常的沉積，這種異常的沉積，和（或）膠原合成、降解的動態平衡失調有關。研究肝纖維化的發生、發展及其治療對策時，應對細胞外基質合成和降解兩方面同時加以觀察，凡是能夠影響膠原合成及/或膠原降解代謝的手段，都是阻斷和逆轉肝纖維化和肝硬化的有效方法[5]。

肝星形細胞是ECM的主要來源，肝星形細胞激活并轉化為肌纖維樣細胞，各種致纖維化因素均把HSC作為最終靶細胞，正常情況下，肝星形細胞處于靜止狀態，當肝臟受到炎癥或機械刺激等損傷時，肝星形細胞被激活，其表型由靜止型轉變為激活型。激活的肝星形細胞一方面通過增生和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成和肝內結構的重建，另一方面通過細胞收縮使肝竇內壓升高。肝星形細胞的激活是肝纖維化發生、發展的關鍵環節。肝（HSC）是肝臟間質細胞之一，是肝纖維化時細胞外基質（ECM）過多產生和沉積的主要細胞來源[6]。針對HSC活化的不同環節進行抗肝纖維化治療已形成了共識，如果能夠抑制膠原等細胞外基質的合成和（或）促進ECM的降解，則有可能緩解、阻止甚至逆轉肝纖維化、早期肝硬化。

肝星形細胞HSC-LI90系表型為活化的人星形細胞，表達高水平的CoL-I、MMP-2、TIMP-1 mRNA等，HSC-LI90是體外研究肝纖維化發生機制、觀察抗肝纖維化藥物作用的較為理想的模型[4]。我們采用中藥組方抗纖復方取其不同濃度的含藥血清觀察了其對HSC-LI90細胞mRNA表達的影響。

Ⅰ型、Ⅳ型膠原是纖維化時病變部位沉積的主要膠原蛋白，Ⅵ型膠原是肝基底膜的主要成分，肝纖維化時含量明顯增高，血中Ⅵ型膠原的水平與肝纖維化程度成正相關。在實驗性肝纖維化模型中，Ⅰ型、Ⅳ型膠原mRNA表達增強，導致其產物過度沉積，Ⅰ型、IV型膠原mRNA在一定程度上可以反映ECM的沉積。我們實驗結果表明，抗纖復方可明顯降低HSC-LI90細胞I型、Ⅳ型膠原mRNA表達水平，從而減少膠原的沉積。

TIMP-1是一種糖蛋白，是ECM主要結構蛋白降解特異酶MMPS的抑制劑，肝纖維化時間質膠原酶活性下降而TIMP-1的表達增加，且與PⅢP、LN正相關，與肝纖維化程度相關。其主要作用是抑制MMP酶原的活化及其對ECM的降解，血清TIMP-1水平反映了慢性肝病肝內炎癥和纖維化的一些重要特征，在目前情況下，是一種肝纖維化無創診斷和隨訪指標。TIMP-1是抑制基質金屬蛋白酶活性的一組多功能因子家族的主要成員之一，能結合除14、19以外的所有MMPs而使其活性減弱，是肝纖維化發生過程中的一個非常重要的促發因素。許多實驗研究表明，肝損傷激活HSC，表達MMPs和TIMPs，在肝損傷早期階段，體外培養的HSC一過性表達MMP3、MMP13等，之后，HSC表型發生變化，前MMP2和MT-MMP表達，MMP2活化，降解局部正常的肝臟基質；并且TIMP-1表達明顯，抑制間質膠原酶（MMP1/MMP13）對膠原的降解。而在肝損傷停止后，TIMP-1迅速減少，膠原酶活性增加，降解ECM，纖維化逆轉[7]。可以證明，TIMP-1在調節膠原的降解代謝中發揮著重要的作用。通過研究我們認為不同濃度抗纖復方含藥血清作用HSC-LI90細胞48h后0.5、2.0、4.0g/kg含藥血清有降低 TIMP-1 mRNA水平的作用，提示抗纖復方具有促進膠原降解的作用。

抗纖復方可明顯降低HSC-LI90細胞CoL-I、CoL-IV、TIMP-1 mRNA表達水平，從而干預肝纖維化及肝硬化時的膠原合成、降解代謝，發揮其抗肝纖維化的作用。

[1]Wang LT, Zhang B, Chen JJ.Effect of Anti-fibrosis compound prescription on collagen expression of hepatic cells of experimental liver fibrosis of rat[J].World J Gastroentrol,2000, 12:877-880.

[2]張斌,王靈臺,陳建杰.抗纖復方影響大鼠肝貯脂細胞生成I、III型膠原的比較研究[J].中國實驗方劑學雜志,2000,6:33-35.

[3]王靈臺,張斌,陳建杰.抗纖復方藥物血清對肝纖維化大鼠肝細胞生成膠原的影響[J].中華消化雜志,1999,19:391-393.

[4]Ozaki I, Zhao G.Hepatocyte growth factor induces collagenase via the transcription factor Ets-1 in human hepatic stellatc cell line[J].J Hepatol,2002,36:169-178.

[5]王寶恩.肝纖維化[J].中華肝臟病雜志,2000,8(4):179.

[6]王寶恩.肝纖維化時細胞外基質的合成與降解[J].中華肝臟病雜志,1997,5(2):65.

[7]Benyon RC,Arthur MJ.Extracellular matrix degradation and the role of hepatic stellate cell[J].Semin Liver Dis,2001,21(3):373.