硫磺素S染色對實驗性無復流的診斷價值＊

駱景光 ，陳韻岱 ，呂 媛 ，田 峰

(1.首都醫科大學附屬復興醫院心內科，北京 100038; 2.中國人民解放軍總醫院心內科，北京 100086;3.首都醫科大學附屬安貞醫院急診科，北京 100029)

無復流(no-reflow phenomenon，NR)現象是急性心肌梗死(AMI)患者發生不良事件的獨立預測因素，其致病機制尚未完全明確，仍缺乏有效的防治方案，因此對NR現象的研究具有重要意義。硫磺素S因內皮熒光染色的特性被應用于實驗性NR現象的研究[1-2]，現初步探討硫磺素S在實驗性NR診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭大白兔10只，購自北京海淀興旺動物養殖場，健康，兔齡11～12周，體重(2.7±0.1)kg，雌雄不拘，為清潔級良種兔。

1.2 兔AMI再灌注模型建立

本研究嚴格遵循國家實驗動物管理條例。兔AMI再灌注模型制備方法詳見文獻[3]。

1.3 硫磺素S染色診斷NR區

再灌注時，以6%硫磺素S 1 mL/kg注入右心房，使復流區著色，NR區不著色。注射15%氯化鉀注射液10 mL后，立即取出心臟，垂直心臟長軸將左心室分為6～7個心肌短軸切片，在暗室365 nm波長的紫外燈下區分復流區(明亮的藍綠色)和NR區(暗色)。

1.4 光鏡病理檢查

分別提取NR區和復流區心肌組織，于10%中性甲醛中固定3 d，石蠟包埋、切片(2.5 mm薄切片)，HE染色后光鏡下(Olympus Co.，Japan)×40，×100和×400放大倍數下觀察心肌組織病理損傷情況。光鏡下，心肌及微循環重度損傷，如心肌纖維廣泛斷裂、大面積收縮帶形成、心肌纖維波浪樣變，毛細血管內皮細胞高度水腫，血管內細胞向心肌間質浸潤，甚至大面積肌溶解為NR區病理改變;心肌組織輕度損傷，僅見輕度心肌纖維波浪樣變和少量收縮帶形成或無心肌損傷為非NR區病理表現。

1.5 統計學分析

用SPSS 11.5統計學軟件進行分析。硫磺素S評價NR區的準確性采用ROC曲線及曲線下面積進行驗證;硫磺素S評價NR區的可靠性采用一致性檢驗，以 P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 硫磺素S染色結果

除1只實驗兔結扎冠狀動脈后突發室顫猝死，2只實驗兔因前降支及右冠狀動脈側支循環過于豐富致造模失敗外，其余7只實驗兔均出現NR區，共提取28塊心肌組織。從相同心肌切片及2只未出現NR區的實驗兔中，共提取了30塊藍綠色區域作為復流區。

2.2 病理學檢查結果

經硫磺素S診斷的28塊NR區心肌組織，光鏡下23塊呈NR區病理改變。5塊呈非NR區或非完全NR區改變，其中3塊心肌取自同一只實驗兔，可見心肌組織彌漫性出血，紅細胞滲入組織，心肌組織病理改變較輕或僅部分心肌組織呈NR區改變(圖1和圖2);其余2塊心肌組織病理損傷較輕，符合輕度缺血改變。經硫磺素S排除的30個非NR區，光鏡下2個呈NR區病理改變，其余28個呈輕中度缺血或為正常心肌組織。見表1。

圖1 硫磺素S染色無復流假陽性區(輕度心肌損傷，彌漫性出血，假NR區)

圖2 硫磺素S染色無復流部分假陽性區(右上象限為NR區病理改變，左下象限呈彌漫性出血，假NR區)

表1 硫磺素S染色與病理學診斷結果比較(個)

2.3 硫磺素S診斷NR區的準確性

以ROC曲線及曲線下面積進行驗證。結果顯示，硫磺素S診斷NR區的敏感性為92.0%，特異度為84.8%，誤診率為15.2%，漏診率為8%，陽性預測值82.1%，陰性預測值93.3%，總符合率為87.9%。

2.4 硫磺素S診斷NR區的可靠性

硫磺素S染色診斷NR區與光鏡評估一致性檢驗的統計量Kappa值為 0.757，P＜0.01。

3 討論

目前，NR現象主要通過心肌聲學造影、冠狀動脈造影、冠狀動脈內Doppler血流等方法判斷[4-5]，此外，冠狀動脈內壓力測定、磁共振成像、單光子發射計算機斷層掃描(SPECT)等也有一定的診斷價值。而對于小型動物實驗研究，以上診斷方法都存在一定難度，且價格昂貴，硫磺素S的應用在很大程度上解決了這些問題。

硫磺素S作為一種高度內皮細胞親和性的熒光染色劑，具有激發光譜和熒光光譜2個特征光譜，分別為430 nm和550 nm，即硫磺素S在430 nm波長激發光照射下可發出550 nm波長的熒光，而550 nm波長為可見綠色光。鑒于尋找單純發射430 nm波長激發光的光源仍存在難度，故采用較常見的365 nm波長的紫外燈為激發光源，硫磺素S染色區則呈現明亮的藍綠色。

既往研究發現[2，6]，在犬的心肌組織中，通過硫磺素S測定的NR區局部心肌血流量灌注較低，波動于0.13～0.39 mL/(g·min)，而正常區心肌局部血流高達1.0 mL/(g·min)。這表明硫磺素S染色可以較準確地反映NR區。本研究結果進一步顯示，硫磺素S診斷NR區的正確性和一致性均較高，尤其是敏感性高達92.0%，總符合率為87.9%，可以精確地區分NR區。同時，本研究結果顯示，硫磺素S評價NR區的特異度為84.8%，經硫磺素S鑒定的28個NR區中，5個為非NR區或非完全NR區改變，其中3個取自同一只實驗兔，可見彌漫性出血、紅細胞滲入組織，而心肌組織病理改變較輕或部分為NR區改變，部分為出血所致假NR區。這提示在動物實驗操作過程中小心細致，盡量減少術中出血，可進一步提高硫磺素S評價NR區的特異度。

綜上所述，在AMI動物模型中，硫磺素S對NR區具有較高的診斷價值，硫磺素S染色可精確區分NR區，而術中心肌組織人為損傷致出血可能是影響硫磺素S染色特異性的一個重要因素。

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