增殖細胞核抗原PCNA在大鼠缺血再灌注腦組織中的表達

陜西中醫學院附屬醫院麻醉科 (咸陽 712000) 安小亮 王 瑞

對腦缺血后神經元損傷機制研究中,DNA損傷和 DNA修復是近年來的熱點。很多研究者發現,腦缺血后不僅發生神經細胞的壞死,在缺血周圍,也即所謂半暗帶區可產生 DNA損傷,由此可以誘導凋亡。

為了修補損傷、保證復制的真實性,生物體內有完善的機制來調控 DNA復制到損傷修復的功能轉換。那么,PCNA在神經系統損傷后 DNA修復中擔任何種角色?目前已知的 PCNA最重要的功能是其在核酸代謝中的作用:PCNA作為 DNA多聚酶δ(Polδ)的輔助蛋白,是 DNA復制合成必不可少的物質[1]。許多研究者做了大量這方面的工作。發現 PCNA在其中起了重要作用。有研究者設計實驗,用紫外線照射 1周齡的小鼠海馬腦片,造成海馬細胞損傷,發現 PCNA在CA3區錐體細胞中表達增高,該實驗結果提示,PCNA在神經系統中非增生細胞中的表達與 DNA的損傷修復密切相關[2]。國內徐廣潤等設計光化學法誘導老齡大鼠局灶性腦缺血實驗,發現缺血后 2h,PCNA表達降低,但 24h后在缺血周邊區有所增強[3]。對大鼠進行缺血預處理后,PCNA陽性細胞在腦缺血區表達,與假手術組相比明顯上調。提示在局灶性腦缺血再灌注過程中,PCNA參與了腦缺血后神經細胞對 DNA損傷的修復過程,PCNA蛋白的表達變化可以影響 DNA損傷的修復過程,受損神經元的功能恢復與 DNA損傷的修復程度相關。本研究主要觀察大鼠在不同程度的腦缺血再灌注后,PCNA的表達改變極其與凋亡的時相與空間關系,探討 PCNA蛋白在腦缺血再灌注后DNA損傷修復中的作用。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物:健康清潔雄性 SD大鼠,體重 250～300g,來自西安交通大學醫學院動物中心.

1.2 水合氯醛(批號:20090613)上海五聯化工廠。多聚甲醛液(批號:20090723)上海邁瑞爾化學技術有限公司。

1.3 550E高清晰彩色圖文分析計算機系統,購自德國萊卡.

2 實驗方法

2.1 SD大鼠全腦缺血模型的建立:SD大鼠 60只,同等條件下常規飼養 1周。按照 Dulsinelli和Brierly方法,采用 4-VO法建立全腦缺血再灌注損傷模型。 IR組:第 1日大鼠以 10%水合氯醛 0.36ml/100g腹腔注射麻醉,麻醉后仰臥固定,頸部正中切口,經胸鎖乳突肌后氣管旁進入,顯露雙側頸總動脈并分離,雙側頸總動脈留置穿線備用,縫合頸部切口。改俯臥位固定于手術臺上,保持大鼠頭前傾約 30度,同時用橡皮栓住鼠尾給以輕度的牽拉力,使頸椎伸直便于觀察。枕骨下第一頸椎水平正中切口,逐層分離皮下筋膜及鈍性分離肌肉,注意嚴密止血,仔細分離兩側第一頸椎橫突,暴露第一頸椎橫突上的翼小孔,翼小孔下有兩側椎動脈通過,用燒紅的探針插入翼小孔,燒灼雙側椎動脈,使之永久閉塞。操作輕柔、仔細,避免損傷脊髓及枕后三角區神經。之后逐層縫合皮下及皮膚。單籠放置,保持室溫于 20～25℃,并用 60W的白熾燈持續照射至清醒,期間用數字電子測溫器間斷測定鼠肛溫,防止體溫下降。密切觀察其蘇醒過程,注意保持鼠呼吸道通暢,直至清醒活動。

第2日(24h后)動物活動后以同樣方法麻醉,仰臥位固定,剪開切口縫線,沿昨日留置線再次游離暴露雙側頸總動脈,以橡皮筋從雙側頸總動脈下方穿過并提拉,阻斷血供 6min,注意避免過度牽拉及夾閉頸內靜脈,期間密切觀察其生命體征變化,可見大鼠瞳孔散大、眼球蒼白、嘴唇發紺,呼吸急促(頸總動脈阻斷2min內瞳孔不散大者予以剔除)。松開橡皮筋予以血液再灌注后,逐層縫合,單籠放置。將鼠置于 20～25℃的室溫中密切觀察其蘇醒過程,期間注意保持鼠呼吸道通暢,直至清醒活動。 PO組除不凝斷椎動脈和阻斷雙側頸總動脈外,操作完全同 IR組。

2.2 標本制備 :所有實驗大鼠分別于再灌注后2h、6h、 12h、 24h、 48h、 72h定點時間給予 10%水合氯醛 0.36ml/100g腹腔注射麻醉后,用加有肝素的 PBS液 100 ml快速灌注心臟,見灌注成功的大腦整體呈均勻的瓷白色。在視交叉后 1 mm和 4 mm處各切一刀取中間小塊腦組織,將組織塊在 4%多聚甲醛液中浸泡,4℃保存 3d后制備成 5M厚海馬薄片。

2.3 PCNA免疫組織化學染色:用免疫組化SABC法染色,按說明書操作。

2.4 凋亡細胞原位檢測(TUNEL法)

2.5 顯微鏡觀察以及陽性判斷:①HE染色,在高倍鏡(40×10)下觀察海馬 CA1區神經元細胞形態結構的改變。②免疫組織化學染色抗原表達,切片中顯示胞核染色為棕褐色顆粒的細胞為 PCNA免疫組化陽性細胞,表達強度以灰度值表示,細胞核或細胞漿無著色為陰性。③TUNEL染色,切片中顯示細胞核有明顯的黃棕色顆粒或斑片為陽性細胞,即凋亡細胞,定量分析方法為:光鏡下計算凋亡指數。凋亡指數(Apoptosis index,AI)計算方法:每只動物隨機兩張切片,每張切片觀察 CA1,分別計算各區凋亡細胞數和總細胞數。 AI=凋亡細胞數 /總細胞數×100%。

2.6 采用德國 Leica-550E高清晰彩色圖文分析計算機系統對陽性結果進行半定量測定,把選出陽性物質賦予棕黃色,得出二值圖,并測出灰度,取平均值。灰度值越高代表表達水平越低。

結 果

1 HE染色結果 PO組高倍鏡下細胞形態完整,排列整齊,結構清晰,胞核藍染,核膜完整,核仁明顯 (圖 1);IR組于再灌注 6h可見 CA1區部分細胞開始出現形態變化,胞體皺縮或腫脹,24h時大量細胞出現形態變化,48h時出現嚴重改變,細胞間質水腫明顯,細胞周圍間隙增寬,神經元數目減少,排列紊亂,分布不均,核膜界限不清,結構模糊(圖 2),至 72h細胞數量明顯減少。

圖1 PO組48h 海馬CA1區 HE染色(×400)

圖2 IR組48h 海馬CA1區 HE染色 (×400)

2 TUNEL法檢測細胞凋亡結果 PO組 CA1區僅可見少量凋亡細胞(表 1);IR組中 CA1區 2h可見散在的凋亡細胞,缺血再灌注后 6h CA1區凋亡細胞開始增加,24～48h為高峰,至 72h明顯減少(P＜0.05,表 1,圖 3)。

圖3 PO組48h 海馬CA1區 TUNEL染色(× 400)

3 全腦缺血再灌注后 DNA修復相關蛋白PCNA的表達 已有多項研究證實 PCNA在 DNA修復機制中具有重要作用,可能也參與了腦缺血以后神經元 DNA損傷的修復。本研究檢測大鼠全腦缺血再灌注后缺血區海馬 CA1區腦組織 PCNA的表達,作為大鼠全腦缺血再灌注后神經元 DNA的修復的觀察指標。 PCNA蛋白在 PO組各時間點于 CA1區均見表達,呈棕褐色位于細胞核內(表 2,圖 4);IR組于再灌注后 2h在海馬 CA1區即可見表達下降,再灌注后 6～24h組明顯下降,之后持續低表達(P＜0.05,表 2,圖5)。

圖4 PO組24h CA1 PCNA的免疫組化染色(× 400)

表1 SD大鼠缺血再灌注后各時點 CA1區凋亡指數的變化(,%)

表1 SD大鼠缺血再灌注后各時點 CA1區凋亡指數的變化(,%)

注:與 PO組比較 P＜0.05

組別 2h 6h 12h 24h 48h 72h PO 0.24± 0.50 1.50± 0.66 1.51± 0.65 1.57± 0.78 2.13± 0.50 1.66± 0.62 I R 2.55± 0.37 14.43± 4.26* 29.25± 6.09* 41.35± 3.28* 38.93± 7.35* 21.35± 5.08*

表2 SD大鼠缺血再灌注后各時點 CA1區 PCNA灰度值(,%)

表2 SD大鼠缺血再灌注后各時點 CA1區 PCNA灰度值(,%)

注:與 PO組比較 P＜0.05

組別 2h 6h 12h 24h 48h 72h PO 106.67± 23.50 105.88± 22.95 107.03± 23.44 106.39± 23.45 105.75± 22.86 106.45± 23.15 IR 122.14± 21.38* 138.78± 21.10* 156.35± 20.72* 206.52± 25.40* 201.67± 25.39* 204.54± 25.72*

圖5 IR組 24h CA 1 PCNA的免疫組化染色(×400)

討 論

與腦缺血再灌注損傷中的眾多因素都可以引起DNA損傷,DNA損傷直接關聯到細胞結構與功能的恢復,是腦缺血再灌注損傷的關鍵。增殖細胞核抗原(PCNA)是一種細胞周期調節蛋白,其合成水平反映了細胞增殖率及 DNA合成率,并與多種細胞周期調節因子密切相關。

研究表明,DNA的損傷與修復在缺血神經元的死亡機制中發揮重要的作用,對 DNA損傷修復的失敗是觸發缺血神經細胞凋亡的重要機制之一[4],在急性腦缺血時,其氧供和能量代謝發生障礙,并在早期有一個活性氧(ROS)產生的高峰,通過氧化應激、游離自由基引起蛋白、脂質和核酸的破壞。核酸的破壞可導致基因表達異常和神經元死亡,在生理條件下,ROS能被抗氧化物和抗氧化酶中和,但當某些氧化應激反應的強度超過抗氧化機制的防御能力時,就可導致氧化性DNA的損傷;這時體內的 DNA修復機制啟動(主要包括堿基切除修復通路和核酸切除修復通路),當修復成功時細胞存活,如果 DNA的損傷不能得以修復時,可啟動調控細胞凋亡的基因,導致細胞凋亡。

本實驗采用免疫組化法觀察缺血后不同時間海馬CA1區 PCNA表達的變化發現:在 PO組及 IR組的不同時間,大鼠海馬 CA1區神經細胞均有不同程度的表達。IR組再灌注 6h PCNA的表達明顯下降,至 24h達到高峰,并持續低表達至 72h,而與此同時,反映神經元 DNA損傷的凋亡細胞數也相繼明顯增加,至 24～48h達到高峰;二者之間呈現明顯的一方表達減弱另一方凋亡細胞數增加的負相關趨勢,這反映腦缺血再灌注之后 DNA受到損傷的同時,作為參與修復DNA堿基損傷重要因子的 PCNA的表達卻明顯下降,并且本實驗中 PCNA表達的低谷還要早于凋亡細胞數的高峰出現,提示包括 PCNA在內的細胞內DNA修復系統也同時受到損害,PCNA的修復能力和修復速度都有一定的局限性,可能受很多因素影響;DNA損傷不能及時得到修復或者不能完全修復,最后就可能造成整個細胞的不可逆損傷。以上與何洪波等[5]的研究接近一致。

綜上所述,增殖細胞核抗原 PCNA主要在缺血再灌注后早期即 24h前損傷未積累到嚴重程度時執行抗凋亡的作用,對損傷神經元 DNA進行修復。提示我們如果能阻止或延遲腦缺血后 PCNA蛋白的減少,將可能提供一些治療機會以降低神經元的損害。因此,今后研究方向可以考慮采取某些干預措施來阻止或延遲腦缺血后 PCNA的減少,或研究能促進 PCNA蛋白表達的藥物,這些方法為臨床防治提供新的思路,將可能在腦缺血損傷中發揮重要的神經保護作用。

[1] 余 芬,袁秀珠.慢性腦缺血大鼠海馬中 APE、PCNA的表達與神經細胞凋亡.山東醫藥,2009,49(33)∶279

[2] Maga G,Hübscher U.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA):a dancer with many partners[J].J Cell Sci,2009,116(15):3051-3060.

[3] 徐廣潤,張 ,楊 淵.老齡大鼠局灶性腦缺血后 DNA修復蛋白:增生細胞核抗原表達的研究.卒中與神經疾病,2000,7(3):129-131

[4] Adkins DL,Voorhies AC,Jones TA.Behavioral and neuroplastic effects of focal endothelin-1 induced sensorimotor cortex lesions[J].Neuroscience,2004,128(3):473-486.

[5] 何洪波,周華東,陳曼娥,等.大鼠局灶性腦缺血再灌注后增殖細胞核抗原對神經功能缺損的影響.中國臨床康復,2004,8(22):4484