黃芪總黃酮對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠IL-4、IFN-γm RNA表達(dá)影響的研究*

陜西中醫(yī)學(xué)院(咸陽(yáng) 712046)楊曉航 史傳道 葉崢嶸 賈文鵬

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的自身免疫性疾病,目前認(rèn)為輔助性 T細(xì)胞(Th)亞群 Th1與 Th2及其分泌的細(xì)胞因子平衡紊亂和失調(diào)是 RA發(fā)病的重要因素[1]。黃芪總黃酮(Flavonoids of ast ragalus,TFA)是中藥黃芪莖葉中提取的有效成分中含量較高的一類(lèi)單體組分。本次研究是在前期 TFA對(duì) Th1與 Th2相關(guān)細(xì)胞因子白介素 4(IL-4)、γ干擾素(IFN-γ)血清含量影響的研究基礎(chǔ)上[2],進(jìn)一步開(kāi)展的 TFA對(duì)模型大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分泌的 IL-4、IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平影響的研究。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 Waster大鼠 30只,雄性,10～12周齡,體重約 150～180g,購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將 30只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、實(shí)驗(yàn)組(治療組),每組 10只。

2 主要儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó) ABI公司 2720型擴(kuò)增儀),凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad公司);Trizol(Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV試劑盒 (美國(guó) GIBCO),Taq DNA聚合酶、d NTP(Promega公司),RPMI1640(Hy Clone產(chǎn)品 ),淋巴細(xì)胞分離液(d=1.083,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所生產(chǎn)),引物由上海生工生物公司合成。TFA由成都科倫藥物研究所提供,完全弗氏佐劑(FCA,購(gòu)自美國(guó) GIBCO),DNA Marker為 DL2000(寶生物公司 )。

3 動(dòng)物模型制備及處理 適應(yīng)性喂養(yǎng) 3 d后,在乙醚輕度麻醉下,用微量注射器于右后足跖皮內(nèi)注射環(huán)磷酰胺(FCA)0.1 ml,約 14 d左右可誘發(fā)成功佐劑性關(guān)節(jié)炎模型[3]。模型組:上法造模成功后,第 15 d生理鹽水灌胃 3 m1/次,1次 /d,連續(xù) 14 d;治療組:上法造模成功后,TFA 250mg/kg體重灌胃,3 m1/次,1次/d,連續(xù) 14 d;正常組:適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后,用生理鹽水灌胃 3m1/次 ,1次 /d,連續(xù) 28 d。

4 外周血 PBMC分離方法 在超凈臺(tái)中,按無(wú)菌操作分離 PBMC細(xì)胞。步驟如下:①取 1 ml肝素鋰抗凝血與 1 ml RPM I1640充分混勻;②在干凈的空離心管中加入 2 ml淋巴細(xì)胞分離液;③沿管壁緩慢將①中稀釋血 2 ml疊加于分層液面上,保持界面清楚;④2 000 r/min水平離心 15min后,吸取單個(gè)核細(xì)胞層,置入另一離心管中;⑤加入 5倍體積的 RPMI1640,1 500 r/min離心 10min;⑥棄去上清后,懸浮細(xì)胞,加入RPM I1640,再次 1 500 r/min離心 10min;⑦棄上清,懸浮細(xì)胞,加入 RPMI1640定容至 1 ml;⑧用RPM I1640將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整到 2×106個(gè) /ml。 所獲細(xì)胞懸液用于 PBMC總 RNA的提取。

5 總 RNA制備及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 見(jiàn)參考文獻(xiàn)[4,5]。

6 PCR反應(yīng) 在 50μl反應(yīng)體系中,包括 10×PCR緩沖液 5μl,50mM MgCl2 2.5μl,10mM d NTP 1μl,10uM上下游引物(見(jiàn)表 1)各 2μl,DNA Taq酶 0.4μl,cDNA 4μl,滅菌雙蒸水 33.1μl,充分混勻 ,簡(jiǎn)短離心。 反應(yīng)條件:95℃ 5min,94℃30s,62℃ 30s,72℃45s,共 35個(gè)循環(huán),再于 72℃延伸 7min。同時(shí)以 β-actin作內(nèi)參照,擴(kuò)增產(chǎn)物用 15g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行,電泳的電壓為 6V/cm,溴化已啶(EB)染色 20min后凝膠圖像分析系統(tǒng)下成像觀察并拍攝。

表1 PCR引物 β-actin、IL-4及 IFN-γ的引物序列[6]

7 RT-PCR凝膠圖像分析 應(yīng)用 Quantity One軟件(Bio-Rad,USA)進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度分析。結(jié)果的判斷以圖像分析軟件讀取的目的電泳帶灰度值與內(nèi)參照βactin條帶的比值作為目的基因 mRNA的表達(dá)量,按下列公式計(jì)算:mRNA的表達(dá)量(相對(duì)強(qiáng)度 relative value,RV)=目的條帶灰度值 /β-actin條帶灰度值[7]。

結(jié) 果

大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá) IL-4mRNA、IFN-γ mRNA逆轉(zhuǎn)錄后再 PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果如附圖所示,擴(kuò)增產(chǎn)物均符合預(yù)期片段大小,內(nèi)參照條帶清晰穩(wěn)定。從圖中我們可以看到,模型組 IL-4 cDNA經(jīng)擴(kuò)增后條帶亮度低于正常組和實(shí)驗(yàn)組,而實(shí)驗(yàn)組條帶亮度略低于正常組。從 IFN-γ表達(dá)情況來(lái)看,模型組條帶亮度強(qiáng)于正常組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組略強(qiáng)于正常組。利用Quantity One軟件分析各組條帶灰度值,然后通過(guò)與內(nèi)參照比較,公式計(jì)算其相對(duì)定量結(jié)果,從表 2我們可以看到模型組大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞 IFN-γmRNA的表達(dá)明顯高于正常組(P＜0.05),經(jīng)用藥治療后,實(shí)驗(yàn)組明顯降低,與模型組比較呈顯著性差異(P＜0.05)。大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá) IL-4mRNA的表達(dá)模型組顯著低于正常組(P＜0.05),治療后實(shí)驗(yàn)組升高,但與模型組比較無(wú)顯著性差異。

討 論

大量研究證實(shí),類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞及滑膜組織中浸潤(rùn)的單核 /巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等通過(guò)自分泌或旁分泌的方式產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì),這些分子相互作用形成了一個(gè)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)都可能對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程產(chǎn)生重要的影響,而參與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的致病過(guò)程[8]。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)痹證之頑痹、骨痹及歷節(jié)病等范疇。

附圖 各組 IL-4m RNA表達(dá)和 IFN-γm RNA表達(dá)

表2 黃芪總黃酮對(duì) IL-4、IFN-γm RNA表達(dá)的影響()

表2 黃芪總黃酮對(duì) IL-4、IFN-γm RNA表達(dá)的影響()

注:與正常組比較*P＜0.05;與模型組比較**P＜0.05;

分組 n IL-4mRNA IFN-γmRNA正常組 10 1.32± 0.79 0.98± 0.61模型組 10 0.79± 0.46* 1.54± 0.57*實(shí)驗(yàn)組 10 1.02± 0.91 1.17± 0.98**

臨床常見(jiàn)癥狀有關(guān)節(jié)腫脹疼痛,晚期嚴(yán)重可引起關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形,功能?chē)?yán)重受損。黃芪為中醫(yī)傳統(tǒng)的益氣藥,有補(bǔ)氣升陽(yáng),固表止汗,利尿消腫,托瘡生肌的功效。多數(shù)治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的組方中,均有大劑量的黃芪[9],可見(jiàn)黃芪在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的治療作用是得到肯定的。黃芪總黃酮是從中藥黃芪莖葉中提取的有效成分中含量較高的組分。現(xiàn)代藥理作用研究表明,它可增加 T細(xì)胞總數(shù)及提高 IL-2所誘導(dǎo)的 LAK細(xì)胞活性[10];同時(shí)對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用可能與其降低血清 LPO及滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的 IL-1和 NO有一定相關(guān)性[11],但以往涉及 Th1與 Th2細(xì)胞亞群平衡紊亂研究較少。 IFN-γ和 IL-4分別是 Th1、Th2細(xì)胞分泌的特征性因子,Th1及 Th2細(xì)胞通過(guò)它們控制下游效應(yīng)細(xì)胞的活性。促炎性 Th1細(xì)胞及其分泌的 IFN-γ和抗炎性 Th2細(xì)胞及其分泌的 IL-4的失衡,是 RA發(fā)病的的重要機(jī)制[12]。 IL-4在 RA中的作用,一是促進(jìn)巨噬細(xì)胞黏附到血管內(nèi)皮細(xì)胞上,然后逸出血管,沿趨化梯度移動(dòng)到炎癥部位;二是通過(guò)促進(jìn) Th2細(xì)胞擴(kuò)增,抑制 Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,從而抑制 RA患者體內(nèi)異常的免疫反應(yīng)。正常機(jī)體的 IFN-γ能阻斷 IL-4對(duì) B細(xì)胞的增殖作用,此外 IFN-γ具有抑制 B細(xì)胞的活化作用[13]。本研究通過(guò)黃芪總黃酮調(diào)節(jié) Th細(xì)胞亞群平衡紊亂,旨在探究類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與 Th1/Th2偏移的相關(guān)性和中藥治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的免疫學(xué)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示造模組外周血中 Th2細(xì)胞因子表達(dá)與對(duì)照組比較較低,Th1細(xì)胞因子較高,Thl/Th2平衡向 Thl偏移,細(xì)胞因子平衡狀態(tài)受到破壞,結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符,證實(shí)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與 Th1細(xì)胞因子有一定相關(guān)性。治療組外周血中 Th2細(xì)胞因子表達(dá)與造模組比較較高,而 Th1細(xì)胞因子與造模組比較降低但無(wú)顯著性差異,表現(xiàn)為 Thl/Th2平衡的 Thl偏移得到糾正,對(duì)糾正 RA的炎性損害有利。綜述以上研究結(jié)果顯示黃芪總黃酮具有糾正 RA大鼠外周血中 Th1/Th2平衡偏移的作用,而達(dá)到防治 RA的目的。

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