電針對擬老年性癡呆大鼠學習記憶和海馬神經元突觸形態可塑性的影響研究

王 威 唐 偉 孫忠人

1)大連大學附屬中山醫院康復醫學科 大連 116001 2)大連大學附屬新華醫院神經內科 大連 116001 3)黑龍江中醫藥大學 哈爾濱 150040

本研究通過建立一個集衰老、鋁中毒以及膽堿能系統損害等多因素的AD動物模型,研究針刺對AD大鼠學習記憶、海馬神經元突觸形態可塑性的影響,以進一步探討針刺改善AD大鼠學習記憶功能的中樞機制,為針刺治療AD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1動物健康雄性Wistar大鼠50只,由大連醫科大學動物實驗中心提供(許可證號為遼實動質字[2000]028號)。自由進食,每日照明12 h,室溫(23±2)°C。

1.2藥品及主要試劑JEM-1220型透射電子顯微鏡;LKB-V超薄切片機;跳臺儀(大連大學附屬新華醫院提供);圖像分析系統(Image Pro Plus 6.0,美國)。

1.3方法

1.3.1 動物分組及處理:按照體質量將50只大鼠隨機分成4組:空白對照組(10只)、空白電針組(10只)、模型組(15只)和模型電針組(15只)。全部實驗動物用相同的飼料喂養,整個喂養過程中所使用的器皿均為非鋁制品。空白對照組:予常規飲水和飼料,并胃飼及腹腔注射與模型組等容量的生理鹽水;空白電針組:在給予生理鹽水同時進行電針治療;模型組:SCOP+AlCl3+D-gal;模型電針組:在造模同時進行電針治療。

1.3.2 穴位選擇:百會:頂骨正中;大椎:第七頸椎棘突與第一胸椎間,背部正中;腎俞:第二腰椎下兩旁;足三里(后三里):膝關節后外側,腓骨小頭下約5 mm處。

1.3.3 針刺方法:用0.25 mm×15 mm毫針針刺大鼠“百會”穴,向前斜刺約 3 mm,“大椎”穴,直刺約 4 mm,雙側“腎俞”穴,直刺進針 5 mm,雙側“足三里”穴,直刺進針 5 mm。連接KWD-808Ⅱ型全能脈沖電療儀,疏波,頻率2 Hz,電壓2 V,強度以肢體輕微抖動為度。1次/d,時間20 min。10 d一療程,間歇1 d,治療三個療程后進行行為學測試。

1.3.4 大鼠行為學檢測:跳臺實驗[1]:電針治療結束后進行跳臺實驗;實驗裝置為15 cm×30 cm×30 cm的被動條件反射箱,箱底鋪以銅柵,銅絲直徑2 mm,間距5 mm;電流強度由一個可調變壓器控制,通以36 V電流,箱內右后側放置一個高和直徑均為4.5 cm的橡皮墊作為大鼠逃避電擊的安全區。將大鼠放入箱中自由活動3 min,熟悉環境,然后箱底通以電流,其正常反應是跳上平臺以躲避傷害性刺激;記錄大鼠首次跳到銅柵上的時間(即潛伏期)和5 min內大鼠跳到銅柵上的次數(錯誤次數),以此作為學習成績。24 h后重復試驗,記錄其第一次跳下橡皮墊的潛伏期和5 min內的錯誤次數,從而反映大鼠的記憶保持能力。

測試結束后,每組隨機取5只動物,經3%戊巴比妥鈉麻醉后,常規心臟灌注后斷頭剝腦,按照大鼠腦立體定位解剖圖譜取海馬區固定、丙酮梯度脫水、浸透、包埋、切片(厚600A0),230目銅網撈片、3%檸檬酸鉛+0.1%醋酸鈾雙重電子染色后電鏡下觀察結果。電鏡觀察首先遵循確認突觸的標準固確認突觸:(1)可見突觸的前后膜;(2)可見致密帶;(3)突觸前膨大內可見3個以上突觸小泡。然后電鏡下大體觀察,按體視學禁線法則,進行突觸形態學參數突觸數密度(Nv)、面密度(Sv)和平均面積(S)的體視學測量。

1.4統計學分析由第一作者完成。數據用±s表示,采用SPSS 13.0進行統計分析。各組間的跳臺實驗潛伏期、錯誤次數、超微結構各參數采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行統計學處理。

2 結果

2.1實驗動物數量分析納入動物50只,48只大鼠進入結果分析,模型組和模型電針組各有1只動物因胃飼誤入氣管致死。

2.2跳臺實驗(潛伏期、錯誤次數)結果表 1顯示,與空白對照組比較,模型組大鼠出現明顯的學習記憶功能障礙,潛伏期縮短,錯誤次數增加(P＜0.01)。與模型組比較,電針治療能夠改善大鼠的學習和記憶功能,延長潛伏期和減少錯誤次數(P＜0.05,P＜0.01)。

表1 各組跳臺實驗(潛伏期和錯誤次數)比較 (±s)

表1 各組跳臺實驗(潛伏期和錯誤次數)比較 (±s)

與空白組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

組別 n 學習記憶潛伏期/s 錯誤次數/次 潛伏期/s 錯誤次數/次空白組 10 30.79±4.02 4.12±1.49 234.60±36.52 0.91±0.56空白電針組 10 32.68±5.67 4.44±1.42 226.11±37.74 0.67±0.51模型組 14 25.60±3.131) 6.32±1.411) 159.30±23.421) 2.51±1.081)模型電針組 14 31.10±4.882) 4.22±1.312) 191.24±33.743) 1.45±0.963)

2.3海馬CA1區突觸電鏡結果空白組、空白電針組神經氈內可見大量突觸,突觸前后成分境界清楚,輪廓完整,突觸前終末內突觸小泡多,分布密集均勻,多為圓形清亮小泡(圖1A和1B)。模型組神經氈內突觸數目減少,突觸前膜不清晰,突觸間隙模糊,前、后膜不明顯,突觸小泡明顯減少甚或消失,突觸前、后膜破壞變薄,典型的突觸結構已不存在(圖1C)。模型電針組神經氈內可見較多突觸,突觸前終末內突觸小泡也較多,可見較多圓形清亮小泡,密集分布,突觸前、后膜較模型組增厚,與空白組接近(圖1D)。表2結果表明,與空白組比較,模型組大鼠海馬CA1區突觸面數密度、面積密度和體積密度勻減小(P＜0.05和P＜0.01);模型電針組大鼠海馬CA1區突觸面數密度、面積密度和體積密度勻有所增大(P＜0.05),提示電針能有效抑制突觸減少。

表2 各組大鼠海馬 CA1區超微結構各參數比較±s)

表2 各組大鼠海馬 CA1區超微結構各參數比較±s)

與空白組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01

電 鏡組別 n 面數密度(個/μ m2)面積密度(μ m2/μ m3)體積密度空白組 5 6.89±1.53 0.66±0.15 0.066±0.016空白電針組 5 6.43±1.42 0.68±0.18 0.063±0.017模型組 5 4.54±1.531) 0.46±0.141)0.041±0.0122)模型電針組 5 6.16±1.323) 0.60±0.143) 0.056±0.0153)

圖1 海馬CA1區突觸超微結構

3 討論

老年癡呆是老年期發生的以認知與智能障礙為主要特點的疾患,中醫又稱為“老年呆病”,其病位在心、腦。早在《黃帝內經》中就有“心者,君主之官,神明出焉”、“心者,五臟六腑之大主,精神之所舍也”等觀點。中醫防治老年性癡呆癥主要是從整體的角度去分析這一病證的內在實質,針對某一病證個體做出客觀的判斷,實施針對性很強的防治措施。本研究所選百會穴為髓海的上輸穴,治療髓海不足健忘、老年性癡呆的要穴;大椎穴是手足六陽經的交會穴,為“諸陽之會”;百會穴和大椎穴均為督脈之穴,二穴相配可通調諸經,激發經氣,增強各臟腑經絡之功效,使腦髓得氣血榮養,促使陰陽平衡。腎俞為膀胱經穴位,可益腎填髓充腦,《靈樞·經脈》言“膀胱足太陽之脈,起于目內眥,上額交巔。其直者,從巔入絡腦”。足三里為強壯保健的要穴,有延緩衰老的作用。如此配穴體現了配穴原則中的局部與遠道取穴的結合運用。數穴合用,臨床上取得較好療效。

有研究表明,D-半乳糖致亞急性衰老模型、慢性鋁中毒和東莨菪堿中毒都能模擬老年癡呆樣改變[2-4],三種因素復合的模型能更貼近AD復雜的病因和病理變化過程,在這種模型上研究針刺作用效果所得出的結論可能更加可靠。從本研究建立的集衰老、鋁中毒與東莨菪堿損害的多因素AD大鼠模型行為學觀察表明,大鼠跳臺測試的觸電潛伏期及5 min錯誤次數與對照組比較均有明顯改變。與空白對照組比較,模型組潛伏期縮短,錯誤次數增多,說明本研究建立的集衰老、鋁中毒與東莨菪堿損害的多因素的AD大鼠模型是成功的;電針治療后潛伏期延長,錯誤次數減少表明針刺能明顯保護和改善多因素損害所造成的大鼠記憶障礙。本研究的結果提示,針刺可改善AD模型動物的學習和記憶能力。

有研究表明,針刺具有拮抗衰老過程中的病理生理變化[5]。電鏡下觀察到電針組海馬區神經氈內可見較多突觸,突觸前終末內突觸小泡也較多,可見較多圓形清亮小泡密集分布。針刺改善AD大鼠學習記憶能力的機制,可能是針刺刺激增加了大鼠由于造模而損傷壞死的邊緣區的記憶突觸,即膽堿能突觸,使其密度增加,從而使殘存的神經元發揮更大的作用,使記憶突觸間隙變窄,得以加速突觸間的傳導功能;同時腦內存在一些神經傳導的旁路,針刺刺激可引起神經沖動,經外周神經傳導至中樞神經系統,經平時少起作用的旁路刺激大腦皮質,從而引起壞死邊緣區突觸數目和結構的改變;突觸后膜致密物質厚度增加,可能與某些酶及其底物蛋白的磷酸化過程引起其分子構型改變有關,這可能是功能變化的形態學基礎。針刺作為一種對機體無損傷性治療手段,將會在臨床防治AD和其他衰老疾病方面發揮重要作用,本研究為臨床進一步推廣提供了必要的實驗依據。

[1]徐淑云.藥理實驗方法學[M].第2版.北京:人民衛生出版社,1994:660.

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[3]朱清華,熊希凱,章錫平,等.鋁對大鼠學習記憶神經遞質腦結構形態的損害[J].同濟醫科大學學報,1992,2l(增):8-10.

[4]李斌,郭德玉,李林.三種老年癡呆動物模型行為學比較[J].中國實驗動物學報,1999,(7):1.

[5]Zhu W,Hu H.A survey of TCM treatment for Alzheimer＇s disease[J].J Tradit Chin M ed,2007,27(3):226-232.