MTHFR基因A1298C多態與缺血性腦血管病的相關性

陳 芳 封青川 鄭 紅 宋 波 賀 穎 連建華 齊 華 談 頌 許予明

1)河南焦作市人民醫院神經內科 焦作 454000 2)鄭州大學基礎醫學院細胞生物與遺傳學教研室 鄭州 450052 3)鄭州大學醫學院附屬第一醫院神經內科 鄭州 450052

目前大量臨床和流行病學研究證實了同型半胱氨酸(Hcy)代謝異常導致的高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia,HcyM)是缺血性腦血管病(ischemic cerebravascular disease,ICVD)重要的獨立危險因素[1-2]。亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MT HFR)是Hcy代謝的關鍵酶,研究發現人體內MT HFR部分多肽位點的錯義突變可導致該酶的活性和穩定性下降,造成Hcy再甲基化生成甲硫氨酸這一代謝過程障礙,導致HcyM。HcyM 可誘導靜止期細胞進入分裂期,刺激血管平滑肌細胞增生[3],促進氧自由基的生成,導致血管內皮細胞損傷,促進血管平滑肌細胞生長,影響凝血和纖溶系統,抑制組織型纖溶酶原激活物的合成,促進血小板黏附和聚集,從而增加心腦血管疾病發病的危險性[4]。目前,M THFR基因被普遍認為是研究各類心腦血管疾病遺傳易感性的主要候選基因。A1298C是MT HFR次常見突變,不同研究關于MTHFR基因多態A1298C與ICVD的關系的研究結論不同,為探討A1298C多態可否作為ICVD的危險因子和在預防ICVD的價值,本文應用Taqman-MGB探針基因分型技術調查A1298C多態在河南漢族人群健康人與ICVD病人的分布并同其他種族和地區的人群進行比較,探討A1298C在ICVD發生過程中的作用。

1 對象

入選標準:(1)1995年中華醫學會第四屆腦血管會議所修定的ICVD診斷標準,經頭顱CT及MRI證實。(2)隨機原則。(3)排除標準:排除低血容量、感染所致的腦梗死和無癥狀性腦梗死,同時排除癲、癌癥以及肝腎功能不全、接受器官移植、嚴重營養不良等。(4)無血緣關系。病例組470例,男292例,女178例,年齡(59±11.3)歲,來自 2004-12～2005-07河南省二甲以上醫院神經內科住院患者。對照組495例,男320例,女175例,年齡(55±10.8)歲,篩選自同期門診體檢的健康老年個體,體格檢查及實驗室檢查均未見異常,并排除心腦血管病或糖尿病家族史者。本研究人群均為河南漢族人。2組間年齡、性別分配經統計學分析,差異無統計學意義。

2 方法

2.1基因組DNA提取采取所有受試者空腹外周血3 mL,采用常規的苯酚-氯仿方法提取基因組DNA。

2.2試驗方法采用病例對照分析方法,用TaqMan-MGB探針PCR方法進行基因分型。PCR引物及 MGB探針用Primer Express Oligo Design v2.0(ABI PRISM)軟件設計(訂購檢測號:C-850486-20,美國ABI公司),反應體系包括一對引物及2個分別檢測不同等位基因的熒光探針,探針的5′端連接FAM(檢測 A 堿基)或 VIC(檢測 C堿基),3′端連接不發光的粹滅基團和一個MGB(minor grove binder)基團。PCR 反應 體系(5 μ L):2.5 μ L TaqMan? Universal PCR Master Mix,(CattNo:4324018,Applied-biosystems Inc.USA)0.06 μ L 40xC-850486-20 探針 ,1 μ L 10-20 ng/L DNA模板,1.44 μ L MilliQ水。PCR循環參數:95℃預變性10 min,92℃變性15 s,退火和延伸均為 60℃1 min,進入45輪循環。TaqM an MGB探針熒光標記的PCR反應在一封閉的管中進行,擴增反應后,目的基因片段被標記呈不同的熒光,通過ABI7900熒光檢測儀對不同熒光自動進行基因分型分析。

2.3統計學處理用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理,基因頻率采用計數法,經χ2檢驗檢測2組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡,樣本具有群體代表性。2組間的基因型頻率和等位基因頻率的比較用χ2檢驗。ICVD是否發生與遺傳基因多態性的關聯程度以比值比(odds ratios,OR)及95%(confidence interval,CI)可信區間表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 A1298C多態性擴增的目的片段標記呈不同的熒光,通過ABI7900基因分析儀檢測不同的熒光進行多態位點分析,自動給出分型結果。VIC探針發出紅色熒光,報告C等位基因,純合野生型CC顯示為紅色,FAM探針報告發出藍色熒光A等位基因,純合突變型AA顯示為藍色,雜合子1298AC則顯示為綠色(圖1)。

圖1 A1298C基因位點TaqMan-MGB探針單核苷酸多態分型圖

3.2 M THFR-A1298C基因型及等位基因頻率分布C等位基因在ICVD組和病例組分別為13.1%和11.2%,2組比較差異無統計學意義。C/C型在ICVD組中7例(1.5%),對照組中3例(0.6%),占全部被檢測者的1.04%。2組間A/C基因型頻率比較差異無統計學意義(表1)。

3.3河南漢族A1298C的基因型、等位基因型分布及同中國及國外不同地區種族人群的比較河南漢族對照組A1298C多態與毛仁芳等[5]研究的3個不同地域漢族人群及其中部分少數民族人群數據比較:新疆漢族人群1298C等位基因頻率為42%,福建漢族人67%,四川漢族人71%,遼寧滿族人28%,寧夏回族人和云南傣族人48%,河南漢族人群分布頻率為11%。將河南漢族1298C等位基因頻率同以上各地域人群相比較,差異具有統計學意義。將河南漢族人A298C基因三型分布與之相比較,差異同樣有統計學意義(表2)。1298C等位基因在意大利和高加索人群的分布頻率均為31%,印第安人 44%,突尼斯人 27%,黎巴嫩人 24%。河南漢族人群A1298C基因三型分布同國外這些人群相比較,差異有統計學意義(P＜0.001)。見表3。

表1 ICVD組和對照組A1298C基因型和等位基因頻率分布 [例(%)]

表2 河南漢族A1298C基因型等位基因分布及同其他地區人群的比較 [例(%)]

表3 河南漢族A1298C基因型等位基因分布及同其他地區人群的比較 [例(%)]

4 討論

A1298C突變位于M THFR基因第7外顯子C端調節區核苷酸1298位點,該位點的腺苷酸突變為胞嘧啶,導致編碼的谷氨酸被丙氨酸取代。有研究認為A1298C純合突變可導致MT HFR的活性降低,被認為是HhcyM的遺傳危險因素[8]。體外實驗表明,A1298C發生突變可使酶活性下降,但并不造成葉酸和Hcy的代謝障礙,而Kumar[8]研究的印度人1298CC型與HhcyM密切相關,這同時與印度人A1298C的高突變率有一定關系,但該學者并未提出該突變與印度人中風疾病關系的結論。

本實驗研究結果顯示,ICVD組和對照組M THFR基因A1298C多態各基因型及等位基因頻率比較,差異無統計學意義,表明河南漢族人群ICVD的發生與A1298C基因多態性無關,分析原因在于:(1)河南漢族人群M THFR基因A1298C等位基因突變率極低;(2)ICVD是一種多因素疾病,是遺傳因素與環境因素、生活習俗等共同作用的結果;(3)參與葉酸、同型半胱氨酸代謝的酶、輔酶及調控基因有多種,調節機制復雜。

我們對495例對照組個體進行基因分型,并同所收集的文獻中中國及國外不同地域相同或不同種族人群對照組人群或健康研究對象數據進行比較發現,河南漢族人群中1298C等位基因頻率最低,為 11%,純合子僅占 1%,其等位基因頻率和基因三型分布同國內部分少數民族及國外其他種族和地區人群相比較,差異具有統計學意義,即使同為中國漢族,不同地區人群之間,亦是如此,這說明 MTHFR基因多態分布可能受到人種、地域、民族、地理環境、樣本量大小等多種因素的共同影響,提示這個位點存在基因多態性的群體和地域變異,同時提示A1298C突變可能與具有地域分布特點的一些疾病有關,有待進一步深入研究。

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