北京地區(qū)棗瘋病植原體16S rDNA基因序列分析

林文力，牟海青，廖曉蘭

（1.湖南農業(yè)大學生物安全科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.中國檢驗檢疫科學研究院動植物檢疫研究所，北京 100029）

植原體（Phytoplasma），原稱類菌原體（Mycoplasma-like orpanism，簡稱MLO）是一類無細胞壁、存在于植物篩管內的專性寄生細菌，主要依靠葉蟬和飛虱等從韌皮部取食的昆蟲傳播，也可由菟絲子和人工嫁接傳病，常引起植物從枝、黃化、花變葉、頂枯等癥狀[1]。綜合世界各地的報道，植原體可引起多達1 000余種植物的系統(tǒng)性病害，涵蓋各類農作物、園藝、花卉、果樹和林木等病害。其中，我國報道的有100多種，給經濟作物造成了巨大損失[2]。由于植原體尚不能進行體外培養(yǎng)，故對其生物學特性研究較少。近年來，隨著分子生物學的迅速發(fā)展，核酸雜交、血清學和PCR等技術的廣泛應用，極大改善了研究者對植原體鑒定和分類的手段[3]。根據植原體通用引物和特異性引物可以特異地擴增出16S rDNA基因序列，這是植原體分類的重要參考依據,也是被國際上普遍接受的植原體鑒定分類方法[4]。

棗樹在我國廣泛栽培，遍布全國各地，是一種重要的經濟作物。棗瘋?。↗ujube witches′-broom，JWB）是由植原體引起的一類病害，棗樹一旦患病,通常在2～3 a內喪失產量并很快導致植株死亡。1981年，王祈楷等通過系統(tǒng)比較，確定了棗瘋病是由植原體侵染所引起的，而不是病毒類或者病毒與植原體的復合侵染所致。棗瘋病發(fā)病過程從外觀上看可分為以下幾個階段：健康葉片→花葉→變態(tài)花蕾→花變葉→叢枝[5]。

本研究對我國北京地區(qū)棗瘋病植原體16S rDNA基因進行PCR擴增及序列測定，并與已知的植原體序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，明確北京地區(qū)棗瘋病的分類地位，以期為棗瘋病植原體的遺傳變異、致病機理等研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病棗樹樣品采自北京昌平區(qū)西峰山村小棗林?？寺≥d體PMD18-T、限制性內切酶及其它酶類等分子生物學試劑均購自TaKaRa公司；PCR產物回收試劑盒、質?；厥赵噭┖匈徸员本┤浇鹕锟萍加邢薰尽?/p>

1.2 植物總DNA提取

照顧沛雯等[6]的方法提取植物樣品的總DNA，于-20℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增、克隆及序列測定

利用Gundersen等[7]設計的通用引物,通過巢式PCR擴增植原體16S rDNA。PCR以植株總DNA為模板,以 R16F2n（5′-GAAACGACTGCTAAGACTG G-3′）和 R16R2（5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAA CCCCG-3′）引物對進行擴增。擴增條件為:94℃預處理 5 min；94℃ 40s，55℃ 1 min，72℃ 2 min，共 35 個循環(huán)；最后72℃10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。PCR擴增出的目標產物純化回收，克隆入PMD18-T載體中，通過PCR篩選陽性克隆，序列測定委托北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.4 序列分析及同源性比較

利用GenBank數(shù)據庫中的BLAST程序對測序結果進行同源性檢索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），通過 DNAMAN5.2.2及 MEGA4.1軟件進行同源性比較及系統(tǒng)關系樹的構建。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果

棗瘋病感病植株總DNA經直接PCR及巢式PCR擴增后,得到大小約1.2 kb的特異片段，片段大小與引物設計的相符，而健康植株和雙蒸水對照均未出現(xiàn)特異擴增帶（圖1）。將此植原體命名為棗瘋病西峰山棗株系（JWB-XFSZ）。

2.2 植原體16S rDNA片段的序列分析

將16S rDNA目的片段克隆后測序，結果表明北京昌平區(qū)西峰山村小棗（JWB-XFSZ）的16S rDNA擴增片段含有1248個核苷酸（表1），G+C的含量為45.7%。利用GenBank中的BLAST程序對測序結果進行同源性檢索，北京昌平地區(qū)棗瘋病與16SrⅤ組各植原體的16S rDNA基因序列同源性達98.5%以上，其中與16S rⅤ組的榆樹黃化有98.96%、與懸鉤子叢枝病有98.64%的同源性。JWB-XFSZ與16SrV-C亞組的棗瘋病韓國株系（登錄號AB052879）同源性最高，達99.51%，而與其它16Sr其它各組的同源性均在95%以下，表明JWB-XFSZ和棗瘋病韓國株系一樣應歸屬于16SrV-C亞組。

表1 JWB-XFSZ 16S rDNA基因的測序結果

2.3 棗瘋病植原體系統(tǒng)樹構建與分析

將已登陸Genebank的部分植原體16S rDNA基因序列下載下來，與JWB-XFSZ所測定的16S rDNA序列進一步進行同源性分析，利用MEGA4.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，JWB-XFSZ與JWB不同地區(qū)的株系；與Elm yellows、Honeylocust yellows、Cherry lethal yellows、Hemp fiber witches-broom、Peach yellows以及 Paper mulberry witches-broom等16SrⅤ組的植原體在同一個進化枝上，說明JWB-XFSZ與16SrⅤ組的親緣關系最近。

圖2 構建28種植原體株系16S rDNA基因核苷酸序列同源關系進化樹

3 討 論

16S rDNA是原核生物染色體基因組中的一種rDNA編碼區(qū)序列，在進化中高度保守，常作為原核生物系統(tǒng)發(fā)育及分類研究的標準方法。本研究運用分子生物學的方法對北京西峰山小棗棗瘋病植原體的16S rDNA進行PCR擴增，并對擴增產物進行克隆、序列測定及同源關系分析,確定了該植原體株系的分類地位。

目前，國內外學者對棗瘋病植原體病原做了大量研究，以期為棗瘋病的防治提供參考依據。Seemüller等[8]認為植原體病害雖發(fā)生在世界各地，但不同組及亞組的植原體在分布上存在明顯的地區(qū)差異，如16S rV-A主要發(fā)生在北美國家，16S rV-C主要發(fā)生在歐洲，而16S rV-B主要發(fā)生在亞洲。從本研究擴增到的棗瘋病植原體16S rDNA基因來看，JWB-XFSZ 株系與 JWB-henan、JWB-Zahuangdazao、JWB-xiangshan、JWB-Junzao 以 及JWB-Kor各株系均只有幾個堿基的差異，說明棗瘋病植原體暫時還未存在株系上的變化。JWB-XFSZ株系與JWB-Kor韓國株系的差異最近，說明北京西峰山棗瘋病植原體與韓國報道的植原體是同一種病害。在本研究過程中在病株樣品中未擴增到其他植原體，說明未存在復合侵染的現(xiàn)象。

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[2]李 永，田國忠，樸春根，等.我國幾種植物上植原體的快速分子鑒別與鑒定的研究[J].植物病理學報，2005，35（4）：293-299.

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[6]顧沛雯，安鳳秋，吳云鋒，等.小麥藍矮病植原體16S rDNA基因片段的比較分析[J].植物病理學報，2005，（5）：403-409.

[7]Gundersen D E,Lee IM.Ultrasensitive detection of phytoplasm as by nested-PCR assays using two universal primer pairs[J].Phytopatholo-gia Mediterranea,1996,35：144-151.

[8]Seemüller E,Marcone C,Lauer U,et al.Current status of molecular classification of the phytoplasmas [J].Journal of Plant Pathology,1998,80（1）：3-26.