OMⅢ株口蹄疫病毒P1-2A-3C腺病毒載體的構建

李 楊，柳紀省,2

（1.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，農業部畜禽病毒學重點開放實驗室，甘肅 蘭州 730046）

口蹄疫是由口蹄疫病毒（Food-and-mouth disease virus，FMDV）引起的一種感染偶蹄動物的急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]，該病一旦爆發，將造成巨大的經濟損失，是OIE規定的一類傳染病。FMDV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約8.5 kb，由5′端非編碼區、一個開放閱讀框和3′端非編碼區和Poly（A）組成[2]。P1編碼區決定著病毒的抗原性和血清型[3]，其結構蛋白基因VP1位于全基因組的2 977～3 615核苷酸位點，編碼213個氨基酸，為主要抗原位點，可產生中和抗體，誘導免疫反應，是重點研究對象[4]。編碼FMDV的3種主要蛋白水解酶分別為L、2A和3C基因。其中，3C是一種極為重要的功能蛋白，其在多聚蛋白的裂解及病毒衣殼的組裝過程中裂解病毒結構蛋白前體P1，最終得到成熟的病毒抗原[5]，還可使帽結構宿主細胞蛋白的合成關閉，為病毒蛋白的合成創造條件[6]。鑒于在蛋白酶3C的作用下前體結構蛋白P1最終裂解為 VP1、VP2、VP3、VP4[7]，組裝成為完整的病毒粒子誘導機體產生保護性免疫應答[8]。筆者選用O型口蹄疫病毒的P1-2A和3C基因，以期獲得能夠高效表達具有免疫原性的FMDV抗原的重組腺病毒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

OMⅢ型口蹄疫病毒、腺病毒表達系統（穿梭載體pAdTrack-CMV、骨架載體pAdeasy-1）；大腸桿菌BJ5183（中國農科院蘭州獸醫研究所提供）；HEK293細胞（由中國農業科學院蘭州獸醫研究所農業部畜禽病毒學重點開放實驗）；克隆載體pMD18-T、JM109、DNA Marker、Pyrobest DNA polymeras、T4DNA連接酶、DNA快速純化回收試劑盒、質粒快速提取試劑盒等（大連寶生物工程有限公司）；限制性內切酶 PacⅠ、PmeⅠ、salⅠ、BglⅡ、xbaⅠ（Biolabs公司）；RNA提取試劑盒（Qiagen公司）；脂質體lipofectAMINE2000（Invitrogen公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）。

1.2 引物的設計與合成

根據GenBank參考序列合成2對引物：P1-2A上 游 引 物 5′-ATAAGATCTACCATGGGAGCC-3′（引入 BglⅡ酶切位點）；P1-2A下游引物 5′-CGCGTCGACTGACATGTCCTC-3′(引入 salⅠ酶切位點)。PCR 擴增條件：95℃ 5 min；95℃ 1 min，60℃30 s，72℃ 3 min，共 30 個循環；72℃延伸 10 min。3C上游引物 5′-GCGGTCGACAAGAAACCTGTC-3′（引入salⅠ酶切位點）；3C下游引物5′-ATATCTAGACTACTCGTGGTG-3′（引入 xbaⅠ酶切位點）。PCR 擴增條件：95℃ 5 min；95℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，共 30個循環；72℃延伸 10 min。以上引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.3 OMⅢ型口蹄疫重組腺病毒穿梭質粒的構建

按Qiagen公司的RNA提取試劑盒說明提取RNA，將總RNA用Oligo（dT）18引物在AMV反轉錄酶的作用下，42℃反轉錄制備cDNA。以獲得的cDNA為模板，用2對特異性引物進行PCR擴增P12A和3C，將目的片段按常規方法連接到pMD18-T載體上。用相應的核酸內切酶進行酶切鑒定，凝膠電泳鑒定后送大連寶生物工程有限公司測序鑒定。將連接產物分別用BglⅡ/salⅠ和salⅠ/xbaⅠ酶切，分別與經同樣兩次酶切的腺病毒穿梭載體pAdTrack進行連接，使其處于強啟動子CMV控制下。將連接產物轉化大腸埃希氏菌JM109，抗性篩選陽性克隆后，提取質粒進行酶切和PCR鑒定，命名為pAdTrack-P12A3C。

1.4 OMⅢ型口蹄疫重組腺病毒質粒的構建

pAdTrack-P12A3C經PmeⅠ線性化后與腺病毒骨架載體pAdeasy-1共同電轉化感受態細菌BJ5183，進行PacⅠ酶切鑒定和PCR鑒定，該重組腺病毒質粒命名為pAd-P12A3C。

1.5 重組腺病毒質粒轉染HEK293細胞及遺傳穩定性檢測

用PacⅠ將pAd-P12A3C質粒線性化后，在Lipofectamine 2000的介導下轉染HEK293細胞，轉染后4～5 d細胞可觀察到綠色熒光，傳代后出現典型的細胞病變。反復凍融后離心，取上清液接種于單層HEK293細胞，并依次傳至第10代。提取每代腺病毒基因組DNA，以此為模板擴增FMDV的P1-2A、3C基因，檢測重組病毒的遺傳穩定性。

2 結果與分析

2.1 目的基因P1-2A、3C的擴增及重組腺病毒穿梭質粒的構建

以篩選出的陽性質粒為模板分別擴增目的片段，擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測分別可見大小約2.3 kb和640 bp的片段條帶，與目的基因大小相符。將穿梭載體pAdTrack和T-P12A同時經限制性內切酶BglⅡ和salⅠ酶切后進行粘末端連接，鑒定連接成功后獲得重組質粒pAdTrack-P1-2A，再用限制性核酸內切酶salⅠ和XbaⅠ同時酶切pAdTrack-P12A和T-3C進行粘末端連接，經瓊脂糖凝膠電泳可見約2.9 kp的條帶，證明P12A和3C基因已成功克隆到了pAdTrack中（見圖1、圖 2、圖 3）。

圖1 O型FMDV 3C基因的擴增

圖2 O型FMDV P1-2A基因的擴增

2.2 重組腺病毒質粒pAd-P12A3C的鑒定

pAd-P12A3C質粒經PacⅠ消化后，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見大小約為4.5 kb的條帶，和預期結果相符。序列測定及分析也證實了目的基因已正確重組到腺病毒骨架載體內（圖4）。

2.3 重組病毒遺傳穩定性和表達的檢測

分別提取1～10代細胞總DNA為模板進行外源基因的PCR擴增，每代均擴增出目的基因，說明重組病毒能穩定遺傳。轉染的單層HEK293細胞48 h后采用間接免疫熒光試驗，在熒光顯微鏡下可見特異的綠色熒光，而轉染腺病毒骨架載體的HEK293細胞經同樣處理后無熒光，證明目的基因在腺病毒載體中成功表達，HEK293細胞中含有FMDV 蛋白（圖 5、圖 6、圖 7）。

圖3 重組穿梭質粒酶切鑒定

圖4 重組腺病毒質粒酶切鑒定

3 討論與結論

圖5 對照組正常HEK293細胞

圖6 接毒試驗組

圖7 重組腺病毒感染HEK293細胞后的綠色熒光表達

目前，世界多數國家都采用疫苗免疫的方法來控制FMD疫情，FMD基因工程疫苗的研究已經歷20 a，由于免疫效果不及傳統的滅活苗，迄今僅有個別的產品上市，且市場占有率非常有限。究其原因，影響FMD基因工程疫苗免疫效力的因素較多，但其中最重要的原因之一是，不論原核表達還是真核表達，也不論是基因重組表達的亞單位疫苗還是用重組DNA進行免疫的核酸疫苗，多數研究工作都是圍繞FMDV單個基因VP1在進行不同途徑的探討，而一些能增強免疫作用的基因卻未被發現和利用[8]。2001年美國的Mary通過對FMDV全結構蛋白基因及非結構蛋白基因功能的研究，根據非結構蛋白（3C蛋白酶）可將全部結構蛋白基因P1的產物加工成結構完整的VP1、VP2、VP3和VP4多肽，從而形成完整的病毒衣殼。因而，就能最大限度地保留病毒顆粒上的多個抗原表位的情況，研究了FMDVP1+3C活載體疫苗。用該疫苗免疫的豬在同居感染試驗中，獲得了5/6的保護。這一試驗結果表明，從全基因組水平篩選出的組合基因表達的融合蛋白的免疫效力已超過常規疫苗[9]。在口蹄疫活病毒載體疫苗研究中，目前FMDV結構蛋白基因已在大腸埃希氏菌、畢赤酵母、轉基因植物和桿狀病毒等表達系統中得到表達[10]，腺病毒載體是繼逆轉錄病毒載體后在基因治療、基因免疫等方面應用開發較早的一種病毒載體。其具有宿主范圍廣、對人致病性低、在增殖和非增殖細胞中感染、表達基因能同時表達多個基因、能在懸浮培養液中擴增等獨特的優點[11]?；谝陨蟽烖c，腺病毒被極其廣泛地應用于體外基因轉導、體內接種疫苗和基因治療等各個領域[12]。

實驗從FMDV全基因組水平篩選具有保護性免疫反應的免疫組合基因（免疫基因的主序列）作為目的基因，將目的基因插入腺病毒表達載體，通過脂質體、電穿孔法轉化293細胞成功實現目的基因的表達。通過不同的分子檢測方法檢測，篩選出高效表達毒株。該試驗為最終研制出安全、高效、實用的能表達FMD抗原的復制缺陷型腺病毒活載體疫苗提供了一些數據。

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