黃鰭金槍魚眼窩油中DHA含量測定方法的優(yōu)化

周 敏，陶寧萍，王錫昌

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

金槍魚（Thunnus obesus），英文名 Tuna。金槍魚種類很多，經(jīng)濟(jì)價值較高的包括藍(lán)鰭金槍魚、馬蘇金槍魚、大眼金槍魚、黃鰭金槍魚、長鰭金槍魚和鰹魚等6種。近年來，黃鰭金槍魚（Thunnus albacores）捕獲量不斷增長，2006年為1.5 Mt[1]。金槍魚罐頭和生魚片加工過程中產(chǎn)生的下腳料大約占總重量的50%～70%，這些下腳料廢棄物主要是金槍魚內(nèi)臟，鰓，暗色肉，魚頭和魚皮等[2]，金槍魚頭眼窩肉脂肪含量高，含有大量的多不飽和脂肪酸，尤其是DHA。DHA，二十二碳六稀酸，俗名腦黃金，人體內(nèi)不能合成，只能從富含DHA食物攝取。它有較高的藥理價值，對于心血管病、炎癥、癌癥、增強(qiáng)免疫力、健腦益智和保護(hù)視網(wǎng)膜等有療效[3]，近年來引起國內(nèi)外廣泛重視。

超臨界CO2萃取法具有操作簡便、無溶劑殘留、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點。GC/MS配備高靈敏度的動態(tài)質(zhì)譜儀和數(shù)據(jù)系統(tǒng)，無需標(biāo)準(zhǔn)品即可對未知物質(zhì)定性。筆者采用超臨界CO2法從黃鰭金槍魚眼窩肉中提取魚油，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)此方法提取魚油的品質(zhì)較好。利用GC/MS外標(biāo)法測定了眼窩油DHA含量，具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為冷凍黃鰭金槍魚頭購于北京中洋環(huán)球金槍魚有限公司，共二批魚，魚頭重4～4.5 kg。

儀器：Speed SFE超臨界CO2萃取儀，購于美國Applied Separations公司；Agilent 6890N-5975i氣相色譜質(zhì)譜儀（USA），色譜柱 DB225 ms（60 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W，USA）。

試劑：DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%），購于美國SIGMA公司；0.5 mol/L NaOH－CH3OH溶液；正己烷、甲醇均為色譜純、氫氧化鈉為分析純。

1.2 樣品前處理

黃鰭金槍魚頭解凍、清洗、去除皮和骨頭，獲得眼窩肉（眼睛周圍的肉）和雜肉（除眼窩肉的肉）。將眼窩肉放入絞肉機(jī)中混勻破碎，然后置-20℃冰箱冷凍備用。眼窩肉的重量約占總魚頭重量的1.4%。眼窩肉脂肪含量約28.5%，雜肉脂肪含量約2.0%。

1.3 超臨界CO2法提取魚油工藝流程

稱取絞碎的眼窩肉35 g裝于萃取釜中，設(shè)定萃取溫度、分離溫度，檢查設(shè)備的氣密性。CO2經(jīng)凈化后進(jìn)入冷凝箱即液化冷凝至流體，與N2一起經(jīng)高壓計量泵加壓至設(shè)定壓力，經(jīng)加熱器加熱至預(yù)定溫度后進(jìn)入萃取釜進(jìn)行萃取。金槍魚油萃取物經(jīng)分離閥放出并收集，再經(jīng)離心后收集魚油，精確稱量魚油的重量。提取率計算公式：

1.4 DHA測定

1.4.1 魚油的快速甲酯化 稱取1 g眼窩油溶于含有10 mL正己烷的帶塞試管中，震蕩10 min，使其完全溶解，再加入2 mL 0.5 mol/L NaOH—CH3OH溶液，振搖后置于50℃水溶液中約30 min，使其完全酯化，取上清液進(jìn)樣。

1.4.2 GC-MS檢測條件 離子源70 eV，流動相He，分流比 30∶1，進(jìn)樣量 1 μL，進(jìn)口溫度 170℃，保持6 min，以5℃/min升溫至230℃，保持30 min。

1.4.3 DHA定量 用正己烷將DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至一系列濃度梯度 0.65、2.15、3.65、5.15、6.65 mg/mL。按照1.4.2條件進(jìn)行測定，采用外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 超臨界CO2法提取魚油最佳工藝條件的確定

根據(jù)中心旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計，以單因素試驗結(jié)果為中心，設(shè)計出響應(yīng)面試驗方案。試驗結(jié)果見表1，通過響應(yīng)面回歸分析，超臨界CO2法萃取金槍魚油的優(yōu)化工藝條件為萃取時間185.7 min，萃取溫度57.8℃，萃取壓力35.8 MPa，金槍魚油萃取率為20.2%。表1中的試驗值與預(yù)測值相似，表明回歸方程和實驗值具有高度的擬合性。對在此條件下提取的眼窩油進(jìn)行DHA含量的測定。

2.2 DHA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)DHA標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度0.65、2.15、3.65、5.15、6.65 mg/mL的出峰面積，繪出峰面積對濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

2.3 眼窩油預(yù)處理方法的選擇

表1 RSM試驗方案及結(jié)果

圖1 DHA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

魚油中脂肪酸的測定通常要先進(jìn)行甲酯化，其作用是把高沸點不易揮發(fā)、汽化的脂肪酸酯先水解或皂化得到脂肪酸和甘油，再使脂肪酸與甲醇反應(yīng)生成相應(yīng)的脂肪酸甲酯（甲酯化）使其變成低沸點易揮發(fā)、汽化的物質(zhì)，或由油脂直接與甲醇發(fā)生醇解反應(yīng)制取脂肪酸甲酯，從而降低汽化溫度，提高分離效果，有利于氣相色譜法分離并逐一測定其組成和含量[4]。通常甲酯化的方法有酸法甲酯化、堿法甲酯化和三甲基硅重氮甲烷甲酯化等。由于酸法甲酯化程度不高；三甲基硅重氮甲烷甲酯化針對游離脂肪酸甲酯化程度較好。因此，本研究采用堿法甲酯化，即NaOH—CH3OH法，該法甲酯化程度高，具有操作簡單、快捷的特點。

魚油快速甲酯化后，用此方法連續(xù)測定5次，測定結(jié)果相對偏差1%，符合色譜定量分析的允許相對偏差范圍，證明該方法具有很好的精密度。

2.4 GC/MS測定方法的選擇

脂肪酸的極性強(qiáng)，根據(jù)相似相容原理，選擇極性強(qiáng)的色譜柱DB 225 ms，它不僅適合于分離脂肪酸，而且熱穩(wěn)定性好高溫不易流失、且漂移小。因此，DB 225 ms色譜柱為最佳選擇。

由于眼窩油中成分較復(fù)雜，含有不同種類的脂肪酸，若采用恒溫測定，分離效果差，因此，選擇程序升溫測定，經(jīng)多次實驗摸索，得到分離效果較好的程序升溫170～230℃，每分鐘上升5℃。

2.5 DHA定性分析

由圖2可知，各個峰的分離效果很好。由于各脂肪酸為同系物，一般按從短碳鏈到長碳鏈的順序出峰，通過NIST譜庫檢索和分析，檢出DHA的出峰時間為42.1 min，還檢測到其他脂肪酸成分如硬脂酸、油酸、花生四烯酸和EPA等多種脂肪酸的出峰時間分別為 20.5、21.0、28.6、30.6 min 等，因而眼窩油含有豐富的脂肪酸成分。由圖3和圖4比較可知，眼窩油中DHA棒圖和NIST譜庫中DHA棒圖相似，證明此試驗誤差小，定性準(zhǔn)確率高。

圖2 眼窩油的脂肪酸總離子流圖

圖3 眼窩油中DHA棒圖

2.6 DHA定量分析

眼窩油中DHA的峰面積是3.55×108在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到濃度為1.96 mg/mL，最后計算得眼窩油DHA的含量為19.6 mg/g，相對總脂肪酸含量為27.1%。因而，黃鰭金槍魚眼窩肉DHA的含量均高于以下幾種淡水魚類（如鱸魚肌肉18.6%、鰱魚肌肉4.0%和鱖魚肌肉6.4%）；也明顯高于以下幾種海洋魚類（如帶魚肌肉14.2%、鯧魚肌肉9.7%和鲅魚肌肉11.1%）[5]。所以黃鰭金槍魚眼窩肉是重要的DHA源。

3 結(jié)論

超臨界CO2法萃取金槍魚油的優(yōu)化工藝條件為萃取時間185.7 min，萃取溫度57.8℃，萃取壓力35.8 MPa，金槍魚油萃取率為20.2%。GC/MS在本檢測條件下對脂肪酸組成分析，具有操作簡便，分離效果好，精密度較好的優(yōu)點。外標(biāo)法是氣相色譜中一種比較理想的定量方法，它操作簡單，計算方便，不需要校正因子。檢測結(jié)果表明，眼窩油中DHA含量較高，為19.6 mg/g，證明眼窩肉是重要的DHA源。

[1]FIGIS.Fisheries Global Information System.FAO[EB/OL].http：//www.fao.org/figis.2006.

[2]Luis A V，Ernesto A，Angela A.Silage preparation from tuna fish wastes and its nutritional evaluation in broilers[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，1999，79：1915-1922.

[3]藤田孝夫.高度不飽和脂肪酸と健康-水產(chǎn)食品と營養(yǎng)餐[M].東京：恒星社厚生閣刊，1981.

[4]范亞葦，鄧澤元，余永紅，等.不同脂肪酸甲酯化方法對共軛亞油酸分析的影響[J].中國油脂，2007，32（1）：52-55.

[5]倪培德.油脂加工技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.