大孔樹脂純化柿葉總黃酮的工藝研究

董江濤，李 燕，徐慧強(qiáng)，蔣橙華

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

柿葉中含有黃酮、Vc、β-胡蘿卜素、生物態(tài)堿和必需氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)和生理活性物質(zhì),其中黃酮類化合物是主要的活性成分之一，具有抗氧化、抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、保肝等作用[1]，在防治中老年人腦動脈硬化、預(yù)防腦血栓形成、腦中風(fēng)后遺癥康復(fù)治療中有輔助作用，在皮膚抗衰老美容等方面也有廣泛開發(fā)應(yīng)用前景[2]。柿葉黃酮類化合物開發(fā)意義重大，但現(xiàn)有的提取方法所得黃酮純度一直不高，因此需要選擇一種較為經(jīng)濟(jì)快速的方式提高黃酮的純度。

大孔樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)的聚合物吸附劑，依靠其表面基團(tuán)與待分離物質(zhì)的作用力不同進(jìn)行吸附與洗脫。其物理化學(xué)性能穩(wěn)定、吸附選擇性好、富集效果好、不受無機(jī)物存在的影響、解吸條件溫和、使用周期長、再生簡便、節(jié)省費用等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化[3]。本試驗通過對10個不同型號的大孔樹脂對比，選取NKA-2樹脂作為純化柿葉黃酮的樹脂，并對其純化參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料

1.1 材料與試劑

柿葉：柿樹科（Ebenaceae）柿樹屬（Persimmonl）柿樹，樹齡三年。11月霜后采集河北大磨盤柿樹樹葉，經(jīng)60℃恒溫烘箱烘干備用。

樹脂:D101型、HPD-826型、HPD-722型、HPD-600型、DM-130型、NKA-9型ADS-17型、ADS-7型（滄州寶恩化工有限公司）；NKA-2型、AB-8型（上海華震科技有限公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物制品檢定所提供；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2.0 cm×60 cm層析柱（上海錦華層析設(shè)備廠）；HL-2恒流泵（上海青浦滬西儀器廠）；WFZUV2000紫外可見分光光度計（尤尼柯儀器有限公司）；sartorius BS210S電子天平（北京塞多利斯天平有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（H2050R-1長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；微量移液槍（德國eppendorf公司）。

2 試驗方法

2.1 樹脂的選擇

大孔樹脂主要是通過其表面的基團(tuán)與待分離物質(zhì)的結(jié)合力不同來實現(xiàn)物質(zhì)分離的，結(jié)合力強(qiáng)弱與基團(tuán)的極性有關(guān)。根據(jù)黃酮類化合物的極性，選取了具有極性、弱極性、和非極性的10個大孔樹脂進(jìn)行篩選，表1為10個型號大孔樹脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)。

表1 10個型號大孔樹脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)

2.2 樹脂的預(yù)處理

經(jīng)篩選后的各樹脂，先用95%乙醇浸泡，于120次/min的搖床內(nèi)震蕩24 h充分溶脹，然后加入去離子水洗至洗出液無白色渾濁；用4倍體積的5%HCl溶液浸泡，于120次/min的搖床內(nèi)震蕩12 h，而后用去離子水速洗至出水pH值為中性；再用4倍體積的5%NaOH溶液浸泡，于120次/min的搖床內(nèi)震蕩12 h，用去離子水洗至pH值中性，濾去水后，于室溫晾干即得[3-4]。

2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取0.010 0 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用60%的乙醇溶解，定容到50 mL容量瓶中，搖勻，得0.200 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別移取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于8個25 mL容量瓶中，各加1.0 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min。再各加1.0 mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻后靜置6 min。繼續(xù)各加入10.0 mL 4%的NaOH溶液，用60%的乙醇稀釋到刻度，靜置15 min。在510 nm處測定吸光度（A），以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，A 為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。

2.4 黃酮溶液配制

將黃酮提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥，得到粗黃酮粉末，取1 g粉末溶解在50 mL 60%的乙醇中，量取0.2 mL，測定黃酮含量，經(jīng)計算得提取粗粉中黃酮含量為18.7%。根據(jù)含量按1∶93.5（g/mL）的比例，配置濃度為2.0 mg/mL的黃酮溶液。

2.5 黃酮含量測定原理及方法

2.5.1 黃酮含量測定原理 黃酮含量測定采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法，其原理是先用亞硝酸鈉還原黃酮，再加硝酸鋁絡(luò)合生成穩(wěn)定的紅橙色化合物，然后以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)，于510 nm（符合定量分析的比爾定律）波長處測定吸光度，計算黃酮類物質(zhì)的含量。

2.5.2 黃酮含量測定方法 準(zhǔn)確量取黃酮溶液1 mL于容量瓶中，加1.0 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻后放置6 min；再加入1.0 mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min；繼續(xù)加入10.0 mL 4%的NaOH溶液，用60%的乙醇稀釋到刻度，放置15 min。在510 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃酮含量[6]。

2.6 10個型號樹脂對柿葉黃酮的吸附率與解吸率的測定

2.6.1 吸附率測定 將選擇的10個不同極性的大孔樹脂進(jìn)行吸附率的測定比較。測定方法為：準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂各1 g于50 mL具塞磨口三角瓶中，加入柿葉總黃酮溶液25 mL（黃酮濃度為2.0 mg/mL），置搖床上振蕩24 h，振蕩頻率為220次/min，充分吸附后過濾，測定濾液中剩余黃酮濃度，按下式計算各樹脂的吸附率式中：Q—吸附率（mg/g），C0—初始濃度（mg/mL），Cr—剩余濃度（mg/mL），V—溶液體積（mL），W—樹脂的質(zhì)量（g）[7]。

2.6.2 解吸率測定 取經(jīng)上述方法充分吸附黃酮后的樹脂各1 g，準(zhǔn)確加入70%的乙醇30 mL，置搖床上振蕩12 h，振蕩頻率為120次/min，過濾，測定濾液中黃酮濃度，根據(jù)黃酮解吸量計算解吸率（%）。

2.7 樹脂純化參數(shù)的優(yōu)化

對2.6.2選取的樹脂的純化參數(shù)工藝進(jìn)行優(yōu)化，分為靜態(tài)吸附與動態(tài)吸附兩部分試驗。靜態(tài)吸附試驗主要考察上樣液pH值、吸附時間、解吸乙醇的濃度的影響。動態(tài)吸附試驗主要從上樣濃度、上樣流速、上樣量、洗脫流速、洗脫終點等方面進(jìn)行考察。當(dāng)流出液吸光度達(dá)上樣液的1/10時，認(rèn)為達(dá)到穿透點停止上樣，計算吸附量。

3 結(jié)果與分析

3.1 10個不同型號樹脂對柿葉黃酮的吸附率與解吸率

如表2所示：吸附率較高的樹脂有：ADS-7、NKA-2、HPD-826，解吸率較高樹脂有：DM-130、HPD-600、NKA-2、HPD-826。綜合比較吸附率與解吸率選取NKA-2作為純化黃酮的較理想樹脂。

表2 10個型號大孔樹脂對黃酮類化合物的吸附率與解吸率

3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1中可以看出，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=9.412 2C－0.005 4（R2=0.999 7），其中C為黃酮濃度（mg/mL），A為吸光度，線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.3 NKA-2樹脂的靜態(tài)吸附試驗

3.3.1 上樣液pH值的考察 分別考察了pH值為2、3、4、5、6 條件下黃酮的吸附率。結(jié)果（見圖 2）可知，當(dāng)溶液的pH值為3時，黃酮的吸附率最高，吸附率隨著pH值繼續(xù)增加而降低。這是因為在酸性較強(qiáng)時易形成“佯鹽”，偏堿性時分子中酚羥基H+易失去，形成離子結(jié)構(gòu)，不易被吸附[8]。

3.3.2 吸附時間的考察 分別考察了1、2、3、4、5、6、8、10、12 h 后黃酮的吸附率，結(jié)果（見圖 3）中得知：吸附率在前3小時內(nèi)增長較快，到達(dá)第5小時樹脂基本達(dá)到吸附平衡。這是因為在吸附的最初階段，樹脂表面與黃酮接觸充分，但隨著吸附時間的繼續(xù)延長，由于孔容的極限，吸附量的增加速率減小。

圖2 pH值對吸附率的影響

圖3 吸附時間對吸附率的影響

3.3.3 乙醇解吸濃度 分別以濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，進(jìn)行解吸，測定解吸液濃度計算解吸率，從結(jié)果（圖4）可看出隨著乙醇濃度的不斷增加，黃酮的解吸率不斷上升，這是由于柿葉中黃酮類化合物的極性決定的。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%后，解吸率增加不明顯，從節(jié)省原料的角度考慮，選取70%作為解吸乙醇的濃度。

圖4 乙醇濃度對解吸率的影響

3.4 NKA-2樹脂的動態(tài)吸附試驗

3.4.1 上樣液濃度的考察 分別以濃度為4、6、8、10 mg/mL的黃酮溶液上樣，計算黃酮的吸附率，從結(jié)果（圖5）可知：隨著上樣液濃度的增加，黃酮的吸附率不斷降低，這是由于在較低的濃度下，黃酮與樹脂能夠充分接觸，吸收較強(qiáng)。大孔吸附樹脂的吸附量一般與上樣液濃度成反比，在低濃度下對吸附有利。在相同流速和相同吸附時間下，若上柱液濃度過大，由于孔容的限制，存在一個吸附極限，所以會有更多的有效物質(zhì)未被充分吸附而流出。

圖5 上樣液濃度對吸附率的影響

3.4.2 上樣量的考察 分別以 1、2、3、4、5、6、7、8 BV的量上樣，檢測上樣后流出液的黃酮濃度，計算NKA-2樹脂的吸附率，結(jié)果（圖6）可知：在上樣量較小的情況下，樹脂對黃酮的吸附基本與上樣量成正比，這是由于起始階段樹脂表面有足夠的基團(tuán)吸附黃酮，隨著上樣量的不斷增大，樹脂表面基團(tuán)不斷飽和，吸附能力逐漸減弱，表現(xiàn)為流出液的濃度升高，當(dāng)C’/C=1/10時即達(dá)到吸附穿透點，認(rèn)為吸附飽和，因此選擇5 BV作為上樣體積。

圖6 上樣量的考察

圖7 上樣流速對解吸率的影響

3.4.3 上樣流速的考察 分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速通過NKA-2樹脂柱，計算樹脂對黃酮的吸附率，結(jié)果（圖7）可知：隨著上樣液流速的增加，黃酮的吸附率不斷降低，上柱液流速主要影響溶質(zhì)向樹脂表面擴(kuò)散，從而決定了吸附效果。如果吸附流速過大，會使樹脂的吸附量下降。因為在相同的吸附速度下，加快流速使得相對吸附時間減少，溶質(zhì)分子來不及擴(kuò)散到樹脂內(nèi)表面，未被充分吸附就流出來了，造成樣品的流失；如果流速過小，試驗周期延長，效率降低。考慮到吸附效果與試驗周期的要求，以2 BV/h作為上樣流速。

3.4.4 洗脫速度的考察 分別以 1、2、3、4、5 BV/h的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液檢測黃酮含量，計算總黃酮的解吸率，結(jié)果（圖 8）可看出，以1、2 BV/h的流速洗脫時，黃酮回收率相近，更高的流速并沒有將黃酮充分解吸，這是由于較低流速下乙醇能夠充分溶解已吸附的黃酮，而過高的流速使得乙醇沒能來得及溶解黃酮就已經(jīng)流走。因此結(jié)合試驗周期的需求，以2 BV/h的流速進(jìn)行洗脫較優(yōu)。

圖8 洗脫流速對吸附率的影響

3.4.5 洗脫終點的考察 取柿葉樣品液（總黃酮含量為4.0 mg/mL），調(diào)節(jié) pH=3，以2 BV/h的流速、5 BV的上樣量加入 NKA-2樹脂柱，進(jìn)行吸附，再以5 BV水洗脫后，用70%乙醇以2 BV/h的速度洗脫，按樹脂床體積收集洗脫液，計算含量，結(jié)果（圖9）可看出，在起始階段，隨著乙醇體積的增大，黃酮的解吸率增加很快，當(dāng)洗脫液用量為6 BV時，解吸率增加緩慢，通過計算得知基本達(dá)到解吸平衡，因此選定6 BV作為洗脫體積。

圖9 洗脫終點的考察

3.5 分離的柿葉總黃酮純度考察

取柿葉樣品液（總黃酮含量為2.0 mg/mL）20 mL平行3份，調(diào)節(jié)pH=3，以BV/h的上樣流速通過NKA-2樹脂柱（2 cm×20 cm），上樣體積為5 BV，以2 BV/h的洗脫流速用70%的乙醇洗脫，收集洗脫液，取10 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，冷凍干燥，測定總黃酮的含量，經(jīng)計算總黃酮的純度分別為51.7%、52.2%、52.1%，平均為52%，測定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，說明經(jīng)NKA-2大孔樹脂處理后的總黃酮含量可達(dá)50%以上，且具有良好的重現(xiàn)性。

4 結(jié)論

通過對大孔樹脂動態(tài)吸附及解吸的相關(guān)因素研究，確定了大孔樹脂分離柿葉總黃酮的最佳工藝：樹脂型號為NKA-2型大孔樹脂，上樣液濃度為4 mg/mL（溶液pH=3），吸附速率為2 BV/h時吸附效果最好，上柱量為5 BV，洗脫最佳工藝為：6 BV的70%乙醇，以2 BV/h的速率洗脫效果最佳。經(jīng)NKA-2處理后的柿葉總黃酮可達(dá)52%，與粗粉中黃酮含量比較，純化了33.8%。

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