觀察植物木質部的3種切片方法比較

朱登峰 ，唐冬英 ，李明芳 ，劉選明

（1.海南大學農學院，海南 儋州 571737；2.湖南大學生命科學與技術研究院，湖南 長沙410082；3.中國熱帶農業科學院生物技術研究所，海南 ?？?571101）

冷凍切片法、石蠟切片法和徒手切片法是實驗過程中常用的3種制作切片方法。冷凍切片主要應用于臨床醫學病理診斷[1]，適于開展細胞免疫化學和原位雜交等研究。這是因為它不需要將樣品經過長時間的脫水包埋，能更好地保證抗原分子的穩定性[2]。徒手切片法是直接利用手拿刀片將植物新鮮材料切成薄片，制成切片的一種方法。徒手切片簡便易行、不需要專門的技術和儀器設備，且在切片過程中不需要特殊的化學試劑處理（如脫水劑及包埋劑），因此在植物材料中廣泛應用[3]。而石蠟切片法是用石蠟作為包埋劑的一種顯微制片方法，為顯微制片技術中最常用的方法之一。如石蠟永久制片、石蠟切片。為了更清楚有效地觀察植物木質部結構，本文采用了一種快速冷凍切片法，并與石蠟切片技術及徒手切片法進行比較，旨在探索出一種相對較好的細胞學切片方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘藍型油菜（Brassica napusL.）N529及擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）哥倫比亞生態型col-4為材料，OCT包埋劑，石蠟，二甲苯，FAA固定劑，36%甲醛，冰醋酸，乙醇，蒸餾水，1%的間苯三酚（95%乙醇配制）和25%的鹽酸等。

1.2 實驗方法

1.2.1 快速冷凍切片法 快速冷凍切片方法如下：取材→置于樣品托頭上→OCT包埋劑包埋→－30℃快速冷凍固定→切片→貼片→染色觀察。首先啟動Leica CM 1800冷凍切片機降溫開關，把機箱溫度降低至-25～-30℃，待溫度穩定時，剪取油菜及擬南芥莖（長約0.1～0.3 cm）置于樣品托頭上，然后直接用OCT包埋劑進行包埋，涂抹均勻，使樣品深埋其中，再置于速凍架上，迅速冷凍并固定在樣品托頭上。包埋劑OCT變白后，把樣品托頭移至切片機的機頭上，擰緊機頭螺絲，搖動旋轉杠桿進行修塊切片。設置切片厚度（25～100 μm），進行切片，在切片上加1～2滴1%間苯三酚和25%鹽酸染色30 min；Nikon倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.2 徒手切片法 徒手切片法如下：取材→徒手切片→濕毛筆將薄片放人盛水培養皿中→挑選透明的薄片→載玻片上染色觀察。

1.2.3 石蠟切片法 石蠟切片法如下[4]：取材→FAA固定液固定24 h→脫水（依次50%、60%、70%、80%、90%、100%、100%乙醇每級1～2 h）→透明（1/2二甲苯+1/2乙醇、純二甲苯、純二甲苯每級2 h）→透蠟（2/3二甲苯+1/3石蠟4～8 h或過夜→1/3二甲苯+2/3石蠟2 h、純石蠟2 h、純石蠟2 h）→包埋→切片、貼片→展片→染色觀察。

2 結果與分析

2.1 3種切片的植物莖組織觀察

木質素是一種復雜的酚類聚合物，包圍于管胞、導管、木纖維等纖維束細胞及厚壁細胞外，并使這些細胞具有特定顯色反應：加間苯三酚溶液數滴，待片刻，再加鹽酸數滴，即顯紅色；在倒置顯微鏡下觀察3種切片結構，實驗過程中可以發現，快速冷凍切片在處理硬度較大的材料時，組織細胞間易破裂（圖1 A），而在處理油菜頂端莖組織和擬南芥嫩莖切片時，可得到較完整且清晰的切片（圖1 B、C）；石蠟切片和徒手切片結構都很完整（圖1 D、E、F）。木質素組織化學染色分析結果顯示石蠟切片經過各級脫水處理后，染色對比度不好，木質素染色顏色不深，為淡紅色。徒手切片容易產生視野較暗的切片（圖1 F），主要可能是切片透明度不夠，厚薄不均勻產生。

圖1 油菜和擬南芥主莖橫切面間苯三酚-HCl組織化學染色圖（100×）

2.2 3種切片方法的比較

3種細胞學切片方法的比較如表1所示，從表中可以看出，3種方法各有優點和缺點。徒手切片法方法簡單，操作簡便，但切片質量不高，對材料有要求；石蠟切片法切片質量好，但操作繁雜，成本較高；快速冷凍切片法比較簡便、有效、易操作，能切出較高質量的切片。

3 討論

在植物學及細胞生物學實驗上，切片制作的質量非常重要，直接影響到教學和實驗的進展。通過應用上述3種切片方法鑒定生物組織中的有機物質，實驗結果顯示：3種方法都可以獲得細胞形態完整、組織結構清晰、對比度較好的切片。徒手切片技術在植物學實驗中應用較早、且比較普遍。它可以觀察新鮮材料組織和細胞的天然色彩，直接觀察活體細胞結構狀態。通常不經染色或經簡單染色后，制成臨時的水裝片，亦可以通過脫水與染色制成永久制片。徒手切片易產生視野較暗的切片，結合石蠟切片的透明劑，觀察效果可能會更好。石蠟切片法為制片技術的經典方法，是植物學、病理學和醫學等學科觀察及判斷細胞組織的形態結構變化的主要方法，也廣泛地用于生物教學實驗和其他許多學科領域的研究中。石蠟切片也與其他新技術相結合，如張舍郁[5]將免疫熒光檢測技術與石蠟切片相結合，用于抗原定位。它還用于細胞原位核酸分子雜交技術中[6-7]，可對材料中被雜交的DNA分子進行定位、定量分析或觀察分析基因表達（mRNA）水平?？焖倮鋬銮衅鄳迷诩毎庖呋瘜W和原位雜交等研究中，主要在于它能很好地保存細胞內生物分子的活性，因此在動物和人體的組織研究中得以廣泛應用。由于植物細胞有細胞壁和大液泡，含水量大，在低溫冷凍過程中容易形成冰晶，硬度變大，材料硬度太大是造成組織切片破碎的主要原因[8]，難以切出結構完整的組織切片；而且細胞內產生的冰晶會損傷細胞的內膜系統，影響其在植物細胞學、細胞免疫化學等研究中的應用。細胞嚴重傷害主要發生在速凍的降溫及解凍的過程中[9]，因此普遍采用冷凍保護劑的方法來解決上述植物冷凍切片中存在的問題。陳丹[2]等用蔗糖保護-液氮速凍法及林月惠[10]用甘油作冷凍保護劑分別進行冷凍切片，從而獲得薄且結構完整的切片；寧代鋒[11]等人采用冷凍切片技術結合適當回溫的方法也制作出了植物細胞基本結構完整的切片。冷凍切片技術已逐漸在植物組織切片中得到應用[12-15]。謝佩松[14]和劉劍鋒[15]等認為通過冷凍切片法可在短時間內（1 d）獲得高質量切片。在快速冷凍切片過程中切片不宜過薄過厚，切片太?。ㄐ∮?0 μm）易碎、易卷曲；反之，切片太厚（大于50 μm），有皺折及折疊形成?？焖倮鋬銮衅ㄖ谱鞯那衅?，整體結構完整，導管、木纖維細胞、韌皮纖維細胞及髓部薄壁細胞結構清晰。實驗證實快速冷凍切片法是一種簡便有效的制作植物組織切片的方法。

表1 3種切片方法的比較

[1]Sathyanesan S N,Antonia D,Rose T,et al.A simplified method for combined immunohisto chemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen，cryocut mouse brain sections[J].Brain Research Protocols,2002,9:214-219.

[2]陳 丹，趙 潔.適合于植物花器官的冰凍切片技術[J].武漢植物學研究，2005，23（3）：285-290.

[3]李 巖，王幼群.徒手切片與植物細胞微管免疫熒光定位[J].農業生物技術學報，1997，7（4）：382-385.

[4]李曉梅.大豆莖頂端分生組織石蠟切片的制備 [J].大豆科學，2008，27（4）：708-710.

[5]張舍郁，程安春，汪銘書，等.間接免疫熒光檢測石蠟切片中鴨腫頭出血癥病毒及抗原定位方法的初步建立 [J].中國農業科學，2008，41（3）：868-874.

[6]程安春，廖永洪，朱德康，等.檢測石蠟切片中鴨病毒性腸炎病毒間接原位PCR方法的建立[J].中國農業科學，2008，41（12）：4365-4371.

[7]王春燕，黃秀燕.適合植物組織原位雜交和原位PCR的切片制作[J].安徽農學通報，2007，13（7）：37-38.

[8]劉劍鋒，程云清，閻秀峰.植物冰凍切片技術的改進[J].南京林業大學學報，2006，30（3）：128-130.

[9]曾繼吾，易干軍，張秋明，等.番木瓜莖尖超低溫保存過程中的細胞超微結構[J].園藝學報，2005，32（1）：15-19.

[10]林月惠，李寒冰，賀新強.高度木質化材料的冰凍切片技術[J].植物學通報，2001，18（1）：118-120.

[11]寧代鋒，尹增芳，張 菁，等.一種簡單快速植物組織冰凍切片方法[J].熱帶亞熱帶植物學報，2008，16（4）：386-389.

[12]張新成，李志剛，李素麗，等.冰凍切片法在植物微管骨架研究中的應用[J].廣西植物，2008，28（2）：164-166.

[13]焦 石，段玉璽，孫 華，等.大豆根部冰凍切片最佳方法試驗[J].湖北農業科學，2009，48（4）：806-808.

[14]謝佩松，徐中根，韋存虛.冰凍切片技術在植物顯微結構和組織化學中的應用[J].生物學雜志，2009，26（3）：72-74.

[15]劉劍鋒，閻秀峰，程云清，等.冰凍切片技術在高山紅景天細胞學研究中的應用[J].東北林業大學學報，2006，34（4）：110，119.