農桿菌介導SAD基因轉化淺白隱球酵母的條件優化

陳東亮，李紀元，范正琪，范妙華，田 敏

（中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江 富陽 311400）

生物質能源的開發利用是解決能源危機的重要途徑之一。植物油脂是生產生物柴油的主要原料來源，具有一定的規模，但高昂的原料成本[1]嚴重限制了該產業發展。利用微生物油脂為原料生產生物柴油的途徑不存在此問題，且具有資源豐富、油脂含量高、碳源利用廣等特點，可以實現大規模工業化生產。

最適合做生物柴油的脂肪酸是：有較長的直碳鏈，最好有一個不飽和雙鍵存在脂肪酸[2]。植物中的Acyl-ACP脫飽和酶定位于質體上，催化植物不飽和脂肪酸生物合成途徑中的第一步脫飽和反應，直接調控著飽和與不飽和脂肪酸的比例。△9硬脂酰-ACP脫飽和酶（Stearoyl-ACP desaturase），簡稱：SAD，是目前研究最多、最廣泛的Acyl-ACP脫飽和酶。該酶催化硬脂酸在第9～10碳原子之間脫氫形成第一個雙鍵，生成油酸。為提高優良產油菌淺白隱球酵母（油脂含量可達細胞干重的65%）脂肪酸的質量，筆者利用基因工程技術將木本油料樹種千年桐（Vernicia Montana）中的SAD基因轉入到淺白隱球酵母，期望通過調節其代謝途徑提高其油脂質量。

與PEG-CaCl2法、醋酸鋰法、電擊法、基因槍法等傳統真菌遺傳轉化方法相比，根癌農桿菌介導法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）具有操作簡便、遺傳穩定、轉化率高、重復性好等優點[3-4]，因此它成為了當前發展最快、應用最廣的遺傳轉化方法之一。筆者利用ATMT法對淺白隱球酵母進行遺傳轉化，并對影響轉化結果的若干關鍵因素進行了研究探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 SAD基因（全長1 191 bp）的真菌表達載體pCAM 2300-sad由本實驗室構建[5]，該質粒攜帶CAMV 35S強啟動子和新霉素磷酸轉移酶基因（NPT II）；根癌農桿菌 LBA 4404、AGL-1（均含質粒pCAM 2300-sad）為本所實驗室保存；高產油脂的淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 試 劑 卡那霉素、利福平、頭孢呋辛鈉和乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）購自上海生工公司，PCR試劑購自TAKARA公司，其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基 LB培養基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化鈉 10 g/L，調 pH 至 7.0；YPD 培養基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH；SM培養基（選擇培養基）：酵母氮基6.7 g/L，葡萄糖20 g/L，調pH至6.0；MM（基本培養基）、IM（誘導培養基）的配制參考文獻[6]。

1.2 方法

1.2.1 農桿菌Ti質粒轉化淺白隱球酵母 將含有質粒pCAM 2300-sad的根癌農桿菌在LB平板培養基（含 50 μg/mL卡那霉素，50 μg/mL利福平）上劃線活化，挑取農桿菌單克隆接種于10 mL液體LB培養基中（含50 μg/mL卡那霉素，50 μg/mL利福平），28℃，180 r/min 振蕩培養 18 h，離心收集菌體。用IM培養基重懸（含50 μg/mL卡那霉素，50 μg/mL利福平），稀釋至OD600至0.15左右，繼續培養5～6 h至OD600為0.4～0.6；接種淺白隱球酵母于10 mL YPD培養基中，28℃，180 r/min振蕩培養18 h后，按1∶5稀釋到YPD新鮮培養基中，培養5～6 h。分別離心收集酵母和根癌農桿菌菌體，用無菌水清洗一次，用IM培養基重懸菌體，農桿菌濃度稀釋至OD600為0.5左右（細胞濃度約1010個/mL），酵母稀釋至OD660為0.7左右（細胞濃度約108個/mL）。各取50 μL加入10 mL IM培養基（含 AS 200 μmol/L）中，25℃，180 r/min 培養過夜后，取 100 μL培養液涂布鋪有微孔濾膜的IM（含AS 200 μmol/L）平板上，25℃倒置遮光培養2 d。

1.2.2 轉化子的篩選 將微孔濾膜轉接到含100 μg/mL卡那霉素，200 μg/mL頭孢呋辛那的SM培養基（SMⅠ）上，培養3～5 d后，將初篩得到的轉化子和野生型淺白隱球酵母同時在含150 μg/mL卡那霉素，300 μg/mL頭孢呋辛那的SM培養基（SMⅡ）平板上劃線，倒置培養3～5 d，觀察其生長情況，仍能夠正常生長的可以初步認定為是陽性轉化子。

1.2.3 轉化子基因組DNA的提取及PCR鑒定采用玻璃珠法提取陽性轉化子基因組DNA。根據千年桐SAD基因序列設計特異引物：上游引物：5'-ATCAATCCTTTCATTTCCCAGTCTC-3'；下游引物：5'-TTATCCACCTACCATCTGCCCAC-3'。PCR 反應條件為：94℃預變性 4 min，94℃變性 30 s，57℃退火30 s，72℃延伸 1 min，30個循環后，72 ℃延伸 10 min。PCR擴增產物采用0.8%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 各影響因子的試驗設計 轉化的基本條件為農桿菌LBA 4404預培養后，調至OD600為0.5左右（細胞濃度約1010/mL），酵母稀釋至OD660為0.7左右（約 108個/mL），各取 50 μL加入 10 mL IM 培養基（含AS 200 μmol/L）中。25℃，180 r/min培養過夜后，取100 μL培養液涂布鋪有微孔濾膜的IM（含AS 200 μmol/L）平板上，25℃倒置遮光共培養 48 h。對某一因子進行研究時其他因子保持不變，單因子設置為：選用LBA 4404和AGL-1兩種農桿菌菌株；酵母濃度分別為 1×106、2.5×106、5×106、1×107、1.5×107、2×107個 /mL；農桿菌濃度分別為 2.5×108、5×108、1×109、2×109、3×109個/mL；共培養時間分別為12、24、36、48、60 h；共培養期 AS 濃度分別為 0、200、400、600、800 μmol/L。每個因子重復 3 次，觀察轉化子生長情況，統計轉化子數量。

2 結果與分析

2.1 轉化子的篩選及PCR鑒定

在SMⅠ培養基上篩選3 d左右后，能清晰觀察到轉化子菌落（如圖1-A），將轉化菌落與野生型淺白隱球酵母涂布在高篩選壓的SMⅡ培養基上，28℃倒置培養3～5 d，生長狀態如圖1-B。野生型酵母的對照不能生長，而大多數轉化子仍能正常生長。據此，初步認仍能正常生長的為陽性轉化子。

圖1 淺白隱球酵母轉化子在SM培養基上的生長

將初步判定的陽性轉化子接種于新鮮的YPD培養基中，28℃，180 r/min振蕩培養36 h，提取基因組DNA進行PCR檢測，同時用野生型淺白隱球酵母做對照。瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。可以看出，大部分轉化子在與陽性對照相應的部位擴增出了特異條帶，而陰性對照沒有此條帶，這初步表明SAD基因已成功導入轉化子。

圖2 轉化子SAD基因的PCR鑒定

2.2 農桿菌菌株對遺傳轉化的影響

在其他條件一致的情況下，實驗選取了LBA 4404和AGL-1兩種不同類型的農桿菌進行介導轉化，其中LBA 4404屬章魚堿型，AGL-1為典型的農桿堿型菌株。每個菌種介導的轉化重復3次，結果顯示兩種農桿菌菌株介導轉化都能獲得陽性轉化子，但菌株AGL-1介導的效率明顯高于菌株LBA4404，約為其2倍，說明AGL-1更適合介導淺白隱球酵母的轉化。

2.3 農桿菌濃度對遺傳轉化的影響

當共培養時酵母的濃度保持5×107個/mL不變時，農桿菌LBA4404起始濃度依次為2.5×108、5×108、1×109、2×109、3×109個/mL，其他條件保持一致。由圖3可知，農桿菌濃度對轉化的影響極大，起初隨著農桿菌濃度的增加，轉化子數目也隨之增加，但當農桿菌的濃度大于1×109個/mL時則會由于農桿菌的嚴重污染而導致轉化子數量減少。因此，實驗中農桿菌的最佳濃度為1×109個/mL。

圖3 農桿菌濃度對轉化的影響

2.4 酵母濃度對遺化轉化的影響

酵母是轉化的受體，其濃度也直接影響著轉化子數目。從圖4可以看出，隨著酵母濃度的增加，轉化子數目開始是增加的。但當酵母濃度超過1×107個/mL時，眾多菌落擁擠在一起給轉化子的辨認和分離造成了麻煩，同時假陽性轉化子比例增加，而酵母濃度在2×107個/mL時，假陽性比例高達80%以上。實驗中酵母起始濃度控制在5×106至1×107個/mL之間效果最佳。

圖4 酵母濃度對轉化的影響

2.5 共培養時間對遺傳轉化的影響

共培養12 h，轉化子為0，無農桿菌污染；共培養24 h，轉化子1個，無農桿菌污染；共培養36 h，轉化子14個，存在農桿菌污染；共培養48 h，轉化子23個，農桿菌污染加重；共培養60 h，已無法分辨轉化子，農桿菌污染嚴重。由此可見，共培養時間若低于24 h，則很難獲得轉化子，隨著共培養時間的延長，獲得的轉化子數目也增多，在培養時間為48 h時達到最高。但培養時間的延長也會導致農桿菌污染的加重以及篩選時農桿菌難以抑制。當共培養時間大于60 h時，嚴重的農桿菌污染導致轉化子無法正常生長。

2.6 共培養期AS濃度

AS在培養中起著誘導農桿菌毒性基因表達，啟動侵染反應的功能。在共培養階段，不同濃度（0、200、400、600、800 μmol/L） 的 AS 對轉化的影響結果如圖5所示。在共培養階段缺少AS的誘導時，僅能獲得極少量的轉化子，但添加200 μmol/LAS后轉化效率得到顯著提高。若繼續提高AS濃度，轉化效率也不會有明顯改善，表明AS濃度為200 μmol/L時毒性基因已被充分激活。

3 小結與討論

圖5 AS濃度對轉化的影響

實驗采用根癌農桿菌介導法，實現了千年桐SAD對淺白隱球酵母的遺傳轉化，獲得了陽性轉化子，并通過PCR檢測出證明SAD基因已經成功轉化到酵母中，初步建立并優化了根癌農桿菌介導淺白隱球酵母的遺傳轉化體系。

不同的農桿菌菌種具有不同的毒性，轉化得到的效率也不同，研究表明，農桿菌AGL-1菌株在許多研究中表現出較高的效率[7]。實驗選用了章魚堿型農桿菌菌株LBA 4404和農桿堿型菌株AG1-1為宿主，結果與上述研究一致：AGL-1介導的效率明顯高于LBA 4404，這可能與菌株AGL-1高活性的Vir基因有關。農桿菌毒性基因的表達需要AS的誘導，AS的應用階段主要有預培養和共培養兩個時期，而共培養時期的作用更為重要，大多數研究者認為共培養期不加AS是不能獲得轉化子的。本實驗在共培養期缺失AS的條件下也獲得了少量的轉化子，但添加AS使得轉化子的數目大大的提高了，這同 Weiguo Fang等轉化綠僵霉（Metarhizium anisopliae）的結果相似。另外，實驗中AS濃度變化對轉化影響不大，說明AS濃度為200 μmol/L時，已能充分激活農桿菌毒性基因的表達。

農桿菌和酵母濃度對轉化都有顯著的影響，農桿菌和受體菌濃度太低都不能得到理想的轉化效率[8]。當農桿菌達到一定濃度后效率達到最高，此時農桿菌濃度繼續增加也不能增加轉化子數量，這主要是由于受體細胞外可用于農桿菌結合的位點數量有限，因此有研究者對農桿菌和受體細胞數量比進行研究，認為這樣更能說明問題。而農桿菌濃度過大時，后期的過度生長會與受體競爭養份和空間[9]而影響轉化子的正常生長，并給轉化子篩選時農桿菌的去除帶來麻煩；酵母的濃度太大，則會導致轉化子不易分辨和假陽性的增加。通常篩選時可以通過增加抗生素和抑菌素濃度的方式抑制農桿菌和假陽性轉化子的生長，但有時也會抑制，陽性轉化子的生長。在本實驗中，共培養時農桿菌濃度為1×109個/mL，酵母為 5×106～1×107個/mL 時可以得到理想的轉化效率并保持較低的假陽性率和農桿菌的污染。農桿菌的附著、T-DNA的切割、轉移以及整合到受體染色體DNA等過程的完成需要一定的時間，這個時間的長短受受體自身特性及轉化條件的影響而不同，低于這個臨界點則不能獲得轉化子。本實驗中共培養時間短于24 h不能得到轉化子，隨著時間的延長轉化子數目也增加，但超過60 h則會由于嚴重的農桿菌污染。除了以上因子，共培養溫度[10]，培養基 pH[11]，載體結構[12]，載體膜等也能影響轉化效果，這些都有待于進一步的研究。

[1]Gerpen J V.Business management for biodiesel producers.NREL Techenical Report，204，NREL/SR-510-36342.

[2]Kaieda M，Samukawa T，Kondo A，et al.Effect of methanol and water contents on productions on production of biodiesel fule from plant oil catalyzed by various lipases in a solvent-free system[J].Biosci，2001，（91）：12-15.

[3]de Groot M J，Bundock P，Hooykaas P J，et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi[J].Nature Biotechnol，1998，16（9）：839-842.

[4]Gouka R J，Gerk C，Hooykaas P J J，et al.Transformation ofAspergillus AwarnoribyAgrobacterium tumefaciens-mediated homologous recombition[J].Nature Biotechnology，1999，（17）：598-601.

[5]范妙華.千年桐硬脂酸脫飽和酶、油酸脫氫酶基因克隆及真菌遺傳轉化研究[D].杭州：中國林業研究院，2008.

[6]Frank LWT，Ringo van W，Caroline BM，et al.A one-step method to convert vectors into binary vectors suited for Agrobacterium-mediated transformation [J].Curr Genet，2004，（45）：242-248.

[7]Kemppainen M，Circosta A，Tagu D，et al.Agrobacterium-mediated transformation of the ectomycorrhizal symbiont Laccaria bicolor S238N[J].Mycorrhiza，2005，（16）：19-22.

[8]高興喜，楊 謙，郭兆奎，等.影響根癌農桿菌介導的木霉菌遺傳轉化因素分析[J].微生物學通報，2005，32（1）：74-78.

[9]Meyer V，Mueller D，Strowig T，et al.Comparison of different transformation methods forAspergillus giganteus[J].Curr Genet，2003，（43）：371-377.

[10]邵彥春，王汝毅，丁月娣，等.農桿菌介導的紅曲菌T-DNA插入突變庫的構建及色素突變子的性質分析 [J].菌物學報，2006，25（2）：247-255.

[11]李 偉，鄭肖蘭，賀春萍，等.根癌農桿菌介導的膠孢炭疽菌遺傳轉化體系的建立[J].植物保護，2008，34（1）：76-81.

[12]龍朝欽，鄧 軍，郝 飛，等.根癌農桿菌介導的煙曲霉轉化條件的優化[J].西部醫學，2008，20（2）：261-264.