流式細胞術定量檢測外周血單個核細胞NF-κB的方法探討

郭曉紅,賈永平,姚海東,劉志蘋

核因子-κB(nuclear fac tor-kappa B,NF-κB)是細胞內一種重要的核轉錄因子,處于各種細胞因子網絡調節的中心環節,在機體生理和病理條件下發揮重要功能,日益受到人們重視。近年來研究[1]發現NF-κB活性變化可能與冠心病的預測、危險分層及預后有關,從而為其早期診斷治療、判斷預后提供理論依據。故快速、靈敏、特異地檢測NF-κB活性變化具有重要的臨床意義。本研究通過觀察NF-κB活性與冠心病冠脈病變之間的關系,探討應用流式細胞術(flow cytometry,FCM)檢測外周血單個核細胞NF-κB活性的實驗方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年5月—2007年11月在山西醫科大學第一醫院心內科確診為冠心病(CHD)的住院患者90例。其中男54例,女36例,年齡45歲～74歲(58.9歲±11.4歲)。根據病情將冠心病患者分為急性心肌梗死(AM I)組、不穩定型心絞痛(UA)組和穩定型心絞痛(SA)組,每組30例。冠心病診斷依據1979年WHO缺血性心臟病診斷標準,排除非冠狀動脈血流動力學改變引起的缺血,并且經冠狀動脈造影(CAG)證實心外膜下至少一支冠脈狹窄≥50%。所有冠心病患者入院后均接受阿司匹林、他汀類、硝酸酯類等治療,高血壓病、糖尿病患者對癥治療,血壓和血糖控制在正常范圍。同時另選CAG結果正常者30例作為對照組,其中男16例,女14例,年齡44歲～61歲(52.0歲±8.3歲)。所有患者均排除嚴重心、肝、腎功能不全,急、慢性感染,惡性腫瘤和自身免疫性疾病。冠心病組與對照組年齡、性別、血壓、體重指數比較無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 主要試劑 Cycle TESTTM PLUS DNA試劑盒(美國Becton Dickinson公司產品),其中包括A液、B液和PI染液;NF-κB p65鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司產品);FITC標記IgG(美國Jackson公司產品);自制紅細胞裂解液(KHCO31.0 g,NH4Cl 8.3 g,EDTA-Na20.037 g,pH 7.2)。FACSCalibur流式細胞儀,美國BECTON DICK INSON公司產品。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 所有入選病例取EDTA抗凝靜脈血2 m L,AM I和UA患者在發病24 h內采血。

1.3.2 單細胞懸液制備 取EDTA抗凝血75μL,加紅細胞裂解液2m L,室溫靜置25m in～30 min,離心(2 000 r/m in)5m in,PBS漂洗,然后加A液250μL,靜置10 min后加B液200μL,再靜置10 m in后即獲得單細胞懸液。

1.3.3 染色和計數 用血紅蛋白吸管吸取單細胞懸液10μL置載玻片一端,W right-Giem sa染色,鏡下證實制備好的單細胞懸液符合要求。往制備好的單細胞懸液中加適量PBS,調整細胞數為1.0×106/m L。

1.3.4 熒光標記 參照Fou lds[2]方法并加以改進,取單細胞懸液500μL加NF-κB p65鼠單克隆一抗工作液25μL(1∶10稀釋),輕輕振蕩混勻,室溫孵育1 h,然后加FITC標記IgG二抗30μL(1∶100稀釋),輕輕振蕩混勻,避光孵育30 m in,最后加PI染液20μL,輕輕振蕩混勻,避光孵育30 m in,3 h內上機檢測。每組實驗均設陰性對照,陰性對照只加二抗,不加一抗(加等量PBS),余處理同實驗組。

1.3.5 流式細胞儀檢測標本 校準流式細胞儀,調整熒光變異值(CV)＜3%,獲取標本,每一個標本至少獲取20 000個細胞數,儲存并以Cell Quest軟件系統分析結果。

2 結 果

2.1 流式細胞術各分析區的確定 在FSC/SSC散點圖中設R1門,代表外周血中單個核細胞區域;在PI/SSC散點圖中設R2門,代表PI陽性細胞核區域;在NF-κB FITC熒光直方圖中設M 1,代表在PI陽性細胞核中NF-κB p65陽性細胞核所占比例和峰的位置。NF-κB活性變化以其在PI陽性細胞核中的陽性率表示。

2.2 外周血單個核細胞內NF-κB活性變化 AM I組和UA組患者的NF-κB活性與對照組相比較差異有統計學意義(P＜0.01);SA組患者的NF-κB活性與對照組比較無統計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 流式細胞術檢測冠心病患者外周血單個核細胞NF-κB活性變化(±s)

表1 流式細胞術檢測冠心病患者外周血單個核細胞NF-κB活性變化(±s)

組別n NF-κB陽性率(%)AM I組30 36.7±8.91)UA組30 12.8±3.41)SA組30 1.8±1.0對照組30 0.8±0.5與對照組比較,1)P＜0.01

3 討 論

NF-κB廣泛存在于真核細胞,通過調控多種細胞因子、趨化因子、黏附分子、生長因子和免疫受體等相關基因表達影響疾病的發生、發展。因此,測定NF-κB活化情況對探討疾病的發生機制和防治具有重要意義。

在靜止細胞中,NF-κB以無活性形式存在于細胞質中,被激活后易位進入細胞核內,引起相應靶基因的轉錄[3]。傳統的檢測方法凝膠遷移率電動分析(EMSA)、免疫化學方法、ELISA、免疫熒光顯微鏡觀察等各有優缺點,如EMSA以同位素標記NF-κB特異性寡核苷酸為探針,檢測其DNA結合活性[4,5]。該方法雖然靈敏度高,但同位素標記對人體有較大危害性,且操作繁瑣、費時,結果重復性差。免疫化學方法和免疫熒光顯微鏡觀察[5],雖然方法簡單,但缺乏客觀性。ELISA測量法[6]具有操作簡便、直接半定量、安全等優點,但其檢測標本為血清或血漿,不能客觀反映究竟是哪些細胞發生了活性改變。

流式細胞術是近年發展起來的一種新的細胞分析技術,廣泛應用于免疫學、腫瘤學、血液學、細胞生物學、細胞遺傳學等方面的研究,具有快速、精確、高靈敏、多參數等特點[7]。本研究應用流式細胞術檢測冠心病不同病變程度患者外周血單個核細胞的NF-κB活性變化,探討NF-κB在冠心病發病中的作用。冠心病的基本病變是動脈粥樣硬化(AS),而炎癥和免疫反應的激活是AS發生、發展以及斑塊不穩定的主要因素[8]。研究表明[9],NF-κB是炎癥過程的主要調控因子,被激活后可誘導單核細胞趨化因子(MCP)、血小板源性生長因子(PDGF)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)等與AS有關的調控基因,從而促進AS斑塊的發展。本研究結果顯示AM I組和UA組患者的NF-κB活性明顯高于對照組(P＜0.01),SA組患者的NF-κB活性與對照組相比無統計學意義,NF-κB活性隨病變程度的加重而增高。提示NF-κB可能參與了冠心病的發病過程,其激活在AS病變發生發展過程中發揮著重要作用。與國內外的一些相關報道相同[10-12]。

流式細胞術最大優點就是細胞的分析檢測均以單個細胞為基礎,通過識別細胞標記物的特異熒光,確定來源細胞,并且可以快速、準確地定量分析細胞內的細胞因子。與傳統的檢測方法相比較,應用流式細胞術檢測外周血單個核細胞的NF-κB活性,不僅標本來源簡便,而且檢測時間大大縮短,操作步驟簡單,方法靈敏、特異,具有其他方法不可比擬的優勢。但不論何種檢測方法,都應結合臨床進行綜合評價,才有其實用價值。

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