高效液相色譜法測定低聚殼聚糖含量

上海市獸藥飼料檢測所 商 軍 王 蓓

低聚殼聚糖由甲殼質(zhì)脫乙酰化的產(chǎn)物殼聚糖降解獲得，從廣義上來說，是相對分子質(zhì)量約10000以下、水溶性好的低分子量殼聚糖；從狹義上而言，是指由2～10個(gè)以β-1，4鍵連接的N-乙酰葡糖胺基構(gòu)成的甲殼寡糖或由2～10個(gè)葡糖胺基和/或N-乙酰葡糖胺基以β-1，4鍵連接構(gòu)成的殼寡糖（鄭建仙，2006；夏文水，2004）。

低聚殼聚糖具有提高動(dòng)物免疫力，增強(qiáng)抗病能力；可代替抗生素、促生長劑，提高飼料效益；對家禽大腸桿菌、傷寒、下痢等病有較好的預(yù)防作用；能夠改善肉質(zhì)等，是一種應(yīng)用前景廣闊的新型飼料添加劑 （陳海燕等，2007；凌明亮等，2006；Tsai等，1999；Suzuki，1996）。 目前飼料工業(yè)中，低聚殼聚糖的質(zhì)量控制和規(guī)范使用尚無國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，而其質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一含量測定就非常重要，有關(guān)此類多糖含量測定主要為HPLC-示差折光測定法（Yasser，2002）或比色法對單糖定量（張偉杰，1994）。此類方法存在殼聚糖水解不完全、分析耗時(shí)、操作繁瑣等問題，故難以推廣使用。為此，本實(shí)驗(yàn)建立更為快速簡便、適用性更強(qiáng)的高效液相色譜法直接測定低聚殼聚糖含量，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究表明，結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters高效液相色譜系統(tǒng)（包括：Waters515泵、2487紫外檢測器、柱溫箱、717自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower色譜工作站）；超聲波清洗器（SB2200 型），pH 計(jì)（ZD-1501，上海雷磁）；低聚殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度：93.4%，批號：LOT20073-0008，SIGMA-ALDRICH）；乙腈（色譜純）；氫氧化鉀（AR）；10 mol/L氫氧化鉀溶液（取氫氧化鉀66 g，加水使成 100 mL，充分?jǐn)噭颍吹?10 mol/L）；磷酸（AR）；磷酸鹽緩沖液（取1.0 mL的磷酸，加水使成2000 mL，充分?jǐn)噭颍灰?0 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)至pH值，以pH計(jì)測定，為2.8～3.0，即得）；冰乙酸（AR）；水（電阻率＞ 10 MΩ·cm，符合GB/T6682一級用水的規(guī)定）；低聚殼聚糖原料（A廠 ， 批 號 ：0801121、0801206；B 廠 ， 批 號 ：T0800213）；畜禽復(fù)合預(yù)混合飼料（C廠，低聚殼聚糖含量：≥5%，0901023、0901024、0901025）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液制備

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 取低聚殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)品約0.11 g（精確至 0.0002 g），置 100 mL棕色容量瓶中，加稀醋酸（1→6，V→V）3 mL，搖勻；加水適量，置超聲波水浴中助溶30 min，冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，充分搖勻，濾過；準(zhǔn)確量取該濾液10.00 mL，置50 mL棕色量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，充分搖勻；經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，濾液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.1.2 試樣溶液制備 分別稱取低聚殼聚糖原料約0.11 g和復(fù)合預(yù)混合飼料約2 g（約相當(dāng)于低聚殼聚糖0.1 g），精確至0.0002 g，置100 mL棕色容量瓶中， 加稀醋酸 （1→6，V→V）3 mL，搖勻；加水適量，置超聲波水浴中助溶30 min，冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，充分搖勻，濾過；精密量取該濾液10.00 mL，置50 mL棕色容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，充分搖勻；經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，濾液作為試樣溶液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：C18柱（長：150 mm，內(nèi)徑：4.6 mm，粒徑：4 ～ 5 μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（pH：2.8 ～ 3.0）-乙腈（95+5，V+V）；流速：1.5 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：195 nm；進(jìn)樣量：20 μL。在上述色譜條件下，空白、低聚殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2 mg/mL）、低聚殼聚糖原料和預(yù)混料試樣溶液（0.2 mg/mL）的典型色譜圖見圖1，保留時(shí)間約為1.6 min，分離度大于1.5。

圖1 流動(dòng)相中乙腈比例對保留時(shí)間和分離度的影響

1.2.3 試樣測定 分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和試樣溶液，按“1.2.2”的色譜條件操作，分別注入液相色譜儀，得標(biāo)準(zhǔn)品和試樣溶液中低聚殼聚糖的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算試樣中低聚殼聚糖含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件確定

2.1.1 檢測波長 配制成一定濃度的低聚殼聚糖溶液 （0.2 mg/mL），用紫外分光光度儀在190～300 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示低聚殼聚糖較為適宜的紫外檢測波長為：195、205 nm及210 nm。分別選擇195、205 nm及210 nm對同一濃度的低聚殼聚糖溶液進(jìn)行測定，以峰面積進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)195 nm作為檢測波長測定的峰面積較205 nm和210 nm處測定的要大，故選擇195 nm作為檢測波長。

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化 本研究采用乙腈與磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，采用Agilent Eclipse XDB C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）， 流速為 1.5 mL/min，檢測波長為195 nm，畜禽復(fù)合預(yù)混合飼料制備的試樣溶液（0.2 mg/mL），進(jìn)樣量為 20 μL，比較了不同比例的乙腈和不同pH值的磷酸鹽緩沖液對試樣溶液中低聚殼聚糖色譜峰保留時(shí)間和分離度的影響。結(jié)果見圖1、圖2。試驗(yàn)結(jié)果表明，試樣溶液中低聚殼聚糖色譜峰保留時(shí)間和分離度均隨流動(dòng)相中乙腈比例的增大而減小，當(dāng)乙腈的比例大于10%時(shí)則導(dǎo)致保留時(shí)間過短，低聚殼聚糖無法與試樣基質(zhì)分離，從而影響試樣的定量測定。比較而言，乙腈比例為5%時(shí)保留時(shí)間和分離效果均達(dá)到最佳。而磷酸鹽緩沖液pH值在2.8～3.0時(shí)保留時(shí)間和分離效果均達(dá)到最佳。優(yōu)化后低聚殼聚糖典型的色譜圖見圖3。

圖2 磷酸鹽緩沖液對保留時(shí)間和分離度的影響

2.1.3 流速 采用Agilent Eclipse C18柱（150 mm×4.6mm，5 μm），檢測波長 195 nm，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（pH：2.8 ～ 3.0）-乙腈（95+5，V+V），低聚殼聚糖試樣溶液 （0.2 mg/mL）進(jìn)樣量為20 μL， 以流速為 0.5、1.0、1.5 mL/min 和 2.0 mL/min分別進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4。試驗(yàn)結(jié)果表明，流速為1.5 mL/min時(shí)，保留時(shí)間和分離效果均達(dá)到最佳。

圖3 低聚殼聚糖的HPLC色譜圖

圖4 流速對保留時(shí)間和分離度的影響

2.2 線性關(guān)系 稱低聚殼聚糖對照品適量（精確至0.0002 g），制成1.126 mg/mL的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液， 分別精密量取 2.50、5.00、10.00、15.00、20.00 mL至50 mL棕色容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。取20 μL注入液相色譜儀，按“1.2.2”的色譜條件操作，記錄色譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，在0.056～0.450 mg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

2.3.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別取“2.2”的低聚殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.225 mg/mL）1 份，按“1.2.2”的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性；取0801121一批試樣，按“1.2.1.2”的試樣溶液制備，分別制備成試樣溶液5份，按“1.2.2”的色譜條件進(jìn)樣，檢驗(yàn)試樣測定重復(fù)性，結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低聚殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）為0.22%，保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.94%；5份低聚殼聚糖試樣峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.16%，系統(tǒng)和樣品測定重復(fù)性均良好。

表1 低聚殼聚糖線性關(guān)系（n=3）

表2 方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 中間精密度實(shí)驗(yàn) 分取T0800213（以a標(biāo)示）和0901023（以b標(biāo)示）一批試樣，分別于不同日期、不同人員和不同設(shè)備，按“1.2.1”的實(shí)驗(yàn)方法對該批試樣的含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，精密度均較好，T0800213含量測定結(jié)果的RSD為0.54%；0901023含量測定結(jié)果的RSD為1.53%。

表3 中間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果%

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取 “2.3.1”的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中0801121 一批試樣溶液， 分別于 0、2、4、6、8、10、24、30 h 和 36 h 進(jìn)樣 20 μL，在 0 ～ 10 h，測得峰面積的RSD為0.89%；在24 h后峰面積顯著下降，說明試樣有部分分解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，試樣溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn) 分別稱取已知含量的復(fù)合預(yù)混合飼料約1 g（精確至0.0002 g），共9份，分置于 100 mL 棕色量瓶中，加稀醋酸（1→6）3 mL，搖勻；加水適量，置超聲波水浴中助溶30 min，冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，充分搖勻，濾過；分別精密量取上述濾液10.00 mL，分置50 mL棕色量瓶中，依高、中、低分別精密加入“2.2”線性關(guān)系中的標(biāo)準(zhǔn)貯備液 （1.126 mg/mL）12.00、10.00、8.00 mL置上述50 mL棕色量瓶，用流動(dòng)相稀釋至刻度，充分搖勻；經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，濾液作為試樣溶液；另取低聚殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.1.1”的標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備操作，制備成標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取20 μL注入液相色譜儀，按“1.2.2”的色譜條件操作，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算測定結(jié)果，結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，試樣不同含量的低聚殼聚糖平均回收率為96.7%，RSD為1.1%，方法的準(zhǔn)確度較好。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果

2.6 試樣測定 分別稱取低聚殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)品及不同來源試樣，按“1.2.1”的溶液制備，分別制備成標(biāo)準(zhǔn)品溶液和試樣溶液，按“1.2.2”的色譜條件操作，分別注入液相色譜儀，得標(biāo)準(zhǔn)品和試樣溶液中低聚殼聚糖的峰面積，按外標(biāo)法分別計(jì)算試樣中低聚殼聚糖含量。按上述方法本實(shí)驗(yàn)室（Ⅰ）與C廠實(shí)驗(yàn)室（Ⅱ）測定同批試樣中的低聚殼聚糖含量，結(jié)果見表5。試驗(yàn)結(jié)果表明，兩實(shí)驗(yàn)室測定原料和畜禽復(fù)合預(yù)混合飼料中低聚殼聚糖含量的結(jié)果無顯著差異。

表5 試樣測定結(jié)果（n=3）%

3 結(jié)論

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本法操作簡便易行、快速，方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性均較好，可用于低聚殼聚糖含量質(zhì)量控制。

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