重組人促甲狀腺激素β亞基的切膠純化及多克隆抗體制備①

李敬華 柳明波 馬 彥 左愛軍 孫 蓓 梁東春 郭 剛

(天津醫科大學代謝病醫院/內分泌研究所,衛生部及天津市激素與發育重點實驗室,天津 300070)

目前國內科研及檢測所需抗hTSH抗體主要依賴于國外公司生產,嚴重制約了國內科研及相關工作的開展。本室自行構建了hTSH β鏈的原核表達系統,表達了重組GST-hTSHβ融合蛋白,進一步純化后可做為免疫原來制備抗hTSH β鏈的抗體。由于大分子重組蛋白在大腸桿菌中高水平表達時易于形成包涵體。雖然易于將包涵體與可溶性蛋白分開,但自包涵體中溶解出目的蛋白則需經過洗滌、溶解、復性和透析脫鹽等多步,在這個過程中易造成蛋白變性、濃度降低,致使動物免疫時不能保持足夠的抗原性和濃度要求。本實驗用切膠純化法純化了GST-hTSHβ重組蛋白,并運用該蛋白免疫了新西蘭大耳朵白家兔,成功制備了相應的高效價抗血清。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 含有pGEX-3X/hTSHβ重組質粒的E.coli DH5α菌株由本室構建及保存[1];BCA蛋白濃度測定試劑盒,免疫佐劑氫氧化鋁購自美國Pierce公司;雄性新西蘭大耳朵白家兔購自北京維通利華實驗動物有限公司,人促甲狀腺激素(hTSH)購自美國Sigma公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。蛋白胨、酵母粉均為Sigma分裝。

1.1.2 器材 ∑960型全自動酶標測定儀(美國Metertech公司);96孔酶標板(丹麥Nunc公司);電泳儀(PowerPacTMHC,Power Supply BIO-RAD);垂直電泳槽(Mini-PROTEAN 3,Cell BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 重組GST-hTSHβ在 E.coli DH5α中的誘導表達 將-80℃保存的含有 pGEX-3X/hTSHβ的 E.coli DH5α菌株復蘇后,挑取單菌落接種于含有100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養基中,37℃震蕩培養14～16小時,按1∶100接種于相同的培養基中,37℃震蕩培養3～5小時,當A600達到0.6左右后,加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L,繼續震蕩培養4～6小時后離心收獲細菌,超聲碎菌后,8 500 r/min 4℃離心15分鐘分別收集沉淀及上清行SDS-PAGE。

1.2.2 切膠制備GST-hTSH β重組蛋白 配制1.5 mm厚度3.3%的濃縮膠和10%的分離膠,將適量包涵體用1 ml 1×上樣緩沖液懸浮,沸水浴5分鐘,進行還原型SDS-PAGE。電泳結束后取下凝膠,在預冷的去離子水中漂洗5分鐘,預冷的0.25 mol/L KCl溶液浸泡10分鐘,蛋白條帶呈現乳白色。準確切割下含有GST-hTSHβ蛋白樣品的凝膠置于研缽中加入液氮充分研磨成粉末狀。加入500 μ l 0.01 mol/L PBS(pH 7.5)充分溶解、混勻后,使用空針式濾器過濾后-20℃保存[2]。BCA法測定所得GST-hTSHβ溶液的蛋白濃度,按照BCA測定試劑盒說明操作。SDS-PAGE,考馬斯亮藍R250染色及 Western blot對純化后的蛋白進行鑒定。

1.2.3 實驗動物的免疫 雄性大耳朵白家兔正常飼養一周,觀察無異常后進行首次免疫。取適量GST-hTSHβ蛋白溶液與同體積氫氧化鋁免疫佐劑混合,室溫持續攪拌30分鐘。首次免疫抗原量按100 μ g/kg于家兔背部皮下10～12點注射;分別于首次免疫后7、28、42、56天進行加強免疫,抗原量減半。每次免疫前從兔耳緣靜脈采血3 ml,分離血清后-80℃凍存備用。

1.2.4 兔抗hTSHβ抗體效價測定 ELISA檢測兔抗hTSHβ抗血清效價。以購買的 hTSH 20 μ g/ml,100 μ l/孔4℃過夜包被96孔酶標板。將免疫后不同時間點采集的兔血清用PBST進行系列稀釋(1∶1 000,1∶2 000,1∶4 000,1∶8 000,1∶12 000),以 PBST(0.01 mol/L PBS含0.05%Tween-20 pH7.4)100倍稀釋免疫前兔血清作為陰性對照。包被好的酶標板洗板后加入1%BSA 溶液 200 μ l/孔,37℃溫育30分鐘;洗板后分別加入陰性對照或不同稀釋度的免疫后血清各100 μ l,37℃30分鐘,洗板后加入HRP標記的羊抗兔IgG 工作液(1∶5 000 稀釋)100 μ l,37℃30分鐘,洗板后加入TMB底物,室溫顯色15分鐘后加入終止液,使用酶標儀讀取450 nm處的吸光度值,并以實驗組吸光值≥2倍陰性對照組吸光值時的最大稀釋度作為該抗體的效價。

1.2.5 血清收集及飽和硫酸銨逐級沉淀粗提IgG首次免疫42天后麻醉下采集家兔血液,獲得抗血清。取血清20 ml,加入等體積0.01 mol/L PBS(pH 7.4)混勻,于4℃緩慢逐滴加入預冷的飽和硫酸銨溶液40 ml,輕輕攪拌混勻后4℃靜置過夜;離心(4℃,12 000 r/min)10分鐘,棄上清;沉淀用12 ml 0.01 mol/L PBS溶解后,緩慢逐滴加入預冷的飽和硫酸銨溶液8 ml,4℃靜置1小時;同上離心后,棄上清;沉淀用13.4 ml 0.01 mol/L PBS溶解,緩慢逐滴加入預冷的飽和硫酸銨溶液6.6 ml,4℃靜置1小時;再次離心,棄上清,沉淀用少許0.01 mol/L PBS溶解,裝入預處理的透析袋中(透析袋用去離子水煮沸10分鐘,換液后重復一次);在4℃冷柜中用20倍體積0.02 mol/L PBS持續透析3天,期間換液數次;透析后溶液經離心(4℃,3 000 r/min,20分鐘)后取上清,用BCA測定試劑盒測定蛋白濃度,分裝后保存于-80℃。分別用于以下兩種方法純化。

1.2.6 DEAE纖維素柱離子交換層析純化IgG 稱取20 g DEAE-32纖維素干粉,用0.5 mol/L NaOH 200 ml浸泡30分鐘,抽濾后用去離子水洗至中性;再用0.5 mol/L HCl 200 ml浸泡30分鐘,抽濾后用去離子水洗至中性;再用0.5 mol/L NaOH 200 ml浸泡30分鐘,抽濾后用去離子水洗至中性。隨后以600ml 0.02 mol/L PBS(pH 7.4)懸浮,常溫下靜置 4小時后傾去細微顆粒。將平衡好的DEAE-32纖維素攪起后沿管壁倒入含有一半柱高0.02 mol/L PBS的層析柱中。取適量體積上述粗純的IgG上樣,收集流出液測定蛋白含量后分裝凍存于-80℃。

1.2.7 Protien A瓊脂糖凝膠親和層析法[3]純化IgG

稱取Protien A SEPHAROSE CL-4B干粉250 mg,加3.5倍體積PBS充分溶脹,室溫平衡過夜。將溶脹好的柱料注入層析柱,使自然沉降。沉好后的柱料約1 ml。用大于5倍柱床體積的PBS沖洗柱料,然后將經飽和硫酸銨粗提后蛋白200 μ l上于柱料上層,4℃靜置過夜。用PBS充分清洗,去除雜蛋白。然后用0.1 mol/L的甘氨酸-HCl(pH 2.8)洗脫目的蛋白。用0.01 mol/L PBS透析后用BCA測定試劑盒測定蛋白含量,并分裝凍存于-80℃。

2 結果

2.1 GST-hTSHβ融合蛋白的切膠純化 對比重組質粒pGEX-3X/hTSHβ和空質粒pGEX-3X的表達產物可見,重組GST-hTSHβ蛋白在大約42 kD左右有大量表達(圖1),主要以包涵體形式存在。目的蛋白占碎菌沉淀樣本總蛋白的百分比為26.57%。BCA法測得碎菌沉淀總蛋白的濃度約為65.77mg/L培養基。經估算,GST-hTSHβ融合蛋白的表達量約為17.48 mg/L培養基。切膠回收后的樣本于SDSPAGE中僅見GST-hTSHβ融合蛋白單一條帶(圖2)。經BCA法測定該回收樣本的蛋白含量為14.92 mg/ml,切膠回收后目的蛋白的收率為85.33%。切膠純化后的GST-hTSHβ蛋白經 Western blot鑒定為目的條帶(圖3)。

圖1 GST-hTSH β重組蛋白表達SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of GST-hTSH β fusion protein

圖2 切膠純化后 GST-hTSH β SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of Gel purified GST-hTSHβ

2.2 ELISA測定免疫所得兔血清抗體效價 經ELISA測定后判定該兔免疫28、42、56天后的抗hTSH的抗體效價分別達到了1∶4 000、1∶8 000和1∶12 000(圖 4)。

圖3 切膠純化后GST-hTSH β Western blot鑒定Fig.3 The analysis of G el purified GST-hTSH β by Western blot

圖4 兔血清抗體效價ELISA檢測Fig.4 Anti-hTSH β specific antibody titers in sera of immunized rabbit by ELISA

圖5 兩種方法純化IgG效果比較Fig.5 Comparision of two methods purified IgG

2.3 兩種方法純化多克隆抗體IgG效果的比較采用BCA法測定蛋白含量,經計算,20 ml血清中經飽和硫酸銨沉淀后血清IgG含量為12.28 mg,平均分成2份,一份用離子交換純化法后 IgG含量在2.61 mg左右,Protien A瓊脂糖凝膠親和層析法純化后IgG含量在4.87 mg左右。采用非還原型 SDSPAGE測定IgG純度,結果如圖5,得到了一定純度的抗體。

3 討論

小分子蛋白質作為免疫原時很難刺激起較高的免疫學反應,這對于制備高效價抗體來說是很不理想的。為了獲得高效價的抗體多將該類分子與大分子蛋白如BSA等相偶聯,以期增強實驗動物的免疫學反應,這一方法已被廣泛應用并獲得了良好的效果[4]。但是偶聯的過程本身較為復雜,同時會損失部分樣品,對于較珍貴的蛋白質來說其代價昂貴。本研究中的重組hTSHβ蛋白也存在該問題,故實驗設計之初就考慮為其加上GST標簽,一方面增加了重組蛋白的免疫原性,另一方面為純化該蛋白打下了基礎。本實驗采用市售的hTSH標準品,而非免疫所用的GST-hTSHβ重組蛋白來監測兔血清中抗TSHβ抗體的效價,既避免了抗GST抗體對效價的影響,也證實了該抗體對正常的hTSH有很好的識別。

免疫所產生抗體的特異性很大方面取決于所使用的免疫原的純度。因此,如欲獲得高特異性的抗體,必須先予純化抗原。不同的重組蛋白需要采用不同的純化方式,通常要用到凝膠過濾,離子交換和親和層析等純化方法[5]。這些方法的應用對實驗室條件和儀器設備要求較高,而且在獲得蛋白質高純度的同時也帶來了低收率的弊病。對于一般的實驗室來說是很難承受蛋白純化過程中的花費和繁瑣的。本室構建的GST-hTSHβ融合蛋白在實驗設計之初擬采用GST親和層析純化,但是在實驗過程中我們發現所純化的融合蛋白并未能達到預期的純度且純化步驟煩瑣費時,往往一次所能純化的蛋白量很有限,為獲得所需蛋白用量需多次反復進行。切膠免疫的應用則為我們提供了便利,所分離的蛋白不僅純度高而且凝膠在研磨后可以起到類似于免疫佐劑樣的作用[6,7]。陳鴻軍[8,9]等的系列研究也證實切膠免疫尚能滿足單克隆抗體的制備。本實驗用該法獲得的抗原成功制備出了hTSHβ的多克隆抗體,其陽性血清效價達1∶12 000。因此,切膠免疫的方法完全可滿足動物抗體制備的需求。與其他蛋白純化方法相比具有以下優點:①簡單易行:可以省去多次洗脫柱子處理柱子的繁瑣工作,無需復雜的儀器設備。②價格低廉:實驗中所用的試劑均為普通試劑,容易得到且便宜,不需要昂貴的蛋白純化柱。③應用范圍廣,可用于絕大多數蛋白的純化。本實驗的結果也證明了這種方法是便捷、高效、經濟的。

對于經飽和硫酸銨粗體后的多克隆抗體IgG,我們應用兩種方法進行純化,并比較純化效果。結果我們認為兩種方法純化后IgG的純度保持一致,但是經Protien A瓊脂糖凝膠親和層析法純化后的IgG濃度較高。認為Protien A瓊脂糖凝膠親和層析法是一種高純度、有實用價值的純化方法[10,11]。

1 馬香書,馬 彥,孫 蓓 et al.大腸桿菌偏嗜性人促甲狀腺激素β亞基編碼DNA序列的克隆及表達[J].天津醫藥,2009;37(5):340-342.

2 景 巍,王轉花.一種快速純化蛋白的電洗脫方法[J].生物技術,2004;14(2):30-32.

3 McCue J T,Kemp G,Low D et al.Evaluation of protein-A chromatography media[J].J Chromatogr A,2003;989(1):139-153.

4 左愛軍,梁東春,郭 剛.重組人ω-干擾素的制備及活性分析中國免疫學雜志[J].2006;22(10):940-943.

5 Roque A C A,Christopher R L,Taipa M A.Antibodies and genetically engineered related molecules:production and purification[J].Biotechnol Prog,2004;20(3):639-654.

6 姜 靜,孫其飛,陳 勇.切膠免疫制備腮腺液高豐度蛋白多克隆抗體[J].北京口腔醫學,2007;15(5):254-256.

7 于在江,馬學恩,周建華.切膠純化表達蛋白包涵體的可行性分析[J].生物技術,2007;17(3):46-48.

8 陳鴻軍,宋翠萍,秦愛建 et al.MDV-1 VP22羧基端在大腸桿菌中高效可溶性表達[J].中國病毒學,2006;21(2):169-172.

9 宋翠萍,陳鴻軍,秦愛建 et al.抗MDV1VP22羧基端單克隆抗體的制備與免疫學特性鑒定[J].細胞與分子免疫學雜志,2007;23(2):183-186.

10 Swinnen K,Krul A,Van Goidsenhoven et al.Performance comparison of protein A affinity resins for the purification of monoclonal antibodies[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2007;848(1):97-107.

11 Hahn R,Shimahara K,Steindl F et al.Comparison of protein A affinity sorbents(Ⅲ):Life time study[J].J Chromatogr A,2006;1102(1-2):224-231.