IL-1β、IL-6和IL-23對原發(fā)性膽汁性肝硬化患者Th17細胞形成的影響①

鄧日輝 陳 穎 黃 羽 孫 靜 何 敏 周 丹 曾 星 陳曲波

(廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院免疫室,廣州 510120)

原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種慢性炎癥性、進行性肝內膽汁淤積性自身免疫性肝病[1]。該病女性多發(fā),與患者體內產(chǎn)生抗線粒體抗體(AMA)特別是其M2亞型密切相關,確切病因至今不明[2]。Th17細胞是近年發(fā)現(xiàn)的以分泌白介素17(IL-17)為主要特征的新的CD4+T細胞亞型,在自身免疫疾病和感染性疾病中發(fā)揮重要調節(jié)作用[3]。新近發(fā)現(xiàn)PBC患者肝組織中Th17細胞明顯高于健康人群[4],Th17細胞過度增殖的確切機制還不清楚。國外報道體外誘導Th17細胞分化與多種細胞因子密切相關,特別是 IL-1β、IL-6和 IL-23等在誘導時起到十分關鍵的作用[5,6]。這些細胞因子是否影響PBC患者Th17細胞的分化,目前尚未見報道。為此,我們從PBC患者和正常人外周血中分離初始T細胞,通過在體外培養(yǎng)中加入IL-1β、IL-6和IL-23,觀察這些細胞因子對PBC患者初始T細胞向Th17細胞分化的影響,并與正常人初始T細胞的分化進行比較,為揭示Th17細胞形成與PBC的相關性提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 PBC患者15例,女性13例,男性2例,平均年齡(51.2±8.6)歲,均為2008年7月-2009年9月來廣東省中醫(yī)院或中山大學醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院就診的PBC患者,在采血前均未用過糖皮質激素類、熊去氧膽酸及其他免疫抑制/增強劑治療。PBC的診斷按照2000年美國肝臟病研究協(xié)會推薦的PBC診治標準:(1)肝內淤膽的臨床癥狀和體征,肝功能指標異常,特別是膽汁淤積的證據(jù);(2)腹部B超、CT或逆行胰膽管造影排除其他膽道梗阻因素;(3)血清抗線粒體抗體(AMA)≥1∶1 000且AMAM2陽性。同時以20例健康獻血者為對照組,年齡、性別與PBC組匹配,其中女性17例,男性3例,平均年齡(48.5±9.7)歲,均無肝臟相關疾病及自身免疫性疾病病史。

1.2 試劑與儀器 人初始CD4+T細胞磁珠分選試劑盒、磁力架、抗人PE-CD45RA均購自德國Miltenyi公司。IL-6、IL-1β購自 Peprotech公司。IL-23購自R&D 公司 。Anti-CD3、anti-CD28、anti-IFN-γ、anti-IL-4,抗人 FITC-CD4、抗人 PE-IL-17、PMA、Inomycin、cell staining buffer、破膜劑和固定劑均購自Biolegend公司。Monensin為Merck公司產(chǎn)品。RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibco公司。葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)購自上海華精生物科技公司。流式細胞檢測儀(FC-500)及其流式結果分析軟件CXP均為Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 外周血單個核細胞(PBMC)的獲取 取正常人和PBC患者靜脈血,肝素抗凝。PBS等倍稀釋,充分混勻后等體積加到葡聚糖-泛影葡胺液面,離心(2 000 r/min,20分鐘)。吸出PBMC后再充分洗滌(1 500 r/min,10分鐘),最后用PBS調整PBMC密度為2×109L-1。

1.3.2 初始T細胞分選及純度確定 取PBS+BSA+EDTA緩沖液重懸PBMC,嚴格按Miltenyi公司磁珠分選試劑盒說明書進行操作,經(jīng)FITC-CD4和PE-CD45RA表面染色后行FCM檢測,CXP軟件分析表明,經(jīng)免疫磁珠技術分選的初始T細胞純度能大于98%。

1.3.3 細胞培養(yǎng) 將初始T細胞以1×109L-1的密度分4組培養(yǎng)在48孔培養(yǎng)板中,每組設2個復孔,每孔 500 μ l,培養(yǎng)第 1天起在各孔均加入 anti-CD3、anti-CD28和 anti-IL-4、anti-IFN-γ作為基礎培養(yǎng)基后,4組再各自加入不同的細胞因子進行誘導培養(yǎng):①不加任何細胞因子為空白對照組;②IL-1β組;③IL-1β+IL-6組;④IL-1β+IL-6+IL-23組。于37℃、50 mL/L CO2孵箱中進行細胞培養(yǎng),隔3 d換液一次,并及時補充相應的細胞因子,培養(yǎng)9 d后在刺激劑PMA、Inomycin與monensin的刺激下繼續(xù)培養(yǎng)4小時,收集培養(yǎng)后之細胞用于FCM檢測。

1.3.4 流式細胞術檢測 將上述收集的培養(yǎng)后細胞,離心洗滌(1 500 r/min,5分鐘)制成細胞懸液,加入抗人FITC-CD4抗體表面染色,室溫避光孵育30分鐘,洗滌(1 500 r/min,5分鐘),固定破膜,加入抗人PE-IL-17抗體胞內染色,室溫避光孵育30分鐘,離心洗滌(1 500 r/min,5分鐘),cell staining buffer重懸后行FCM檢測,CXP軟件分析各自Th17細胞分化頻率。

1.4 統(tǒng)計學分析 運用SPSS13.0軟件統(tǒng)計包,所有數(shù)據(jù)用中位數(shù)(四分位間距)[M(Q)]表示,兩組間比較采用Wilcox符號秩和檢驗,多組間比較采用Friedman秩和檢驗,多組間的兩兩比較采用Bonferroni法,檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 空白組 在僅加入 anti-CD3、anti-CD28和anti-IL-4、anti-IFN-γ培養(yǎng)時,正常人及PBC患者的初始T細胞向Th17細胞分化的頻率均很低(＜1%)。

2.2 IL-1β組 在基礎培養(yǎng)劑條件下加入IL-1β共培養(yǎng)時,經(jīng)FCM檢測發(fā)現(xiàn):Th17細胞分化頻率顯著高于空白對照組,兩組有顯著性差異(P＜0.01)。

2.3 IL-1β+IL-6組 在基礎培養(yǎng)劑條件下同時加入IL-1β和IL-6共培養(yǎng)后,Th17細胞分化頻率明顯高于未加細胞因子的空白對照組(P＜0.01);但IL-1β+IL-6組與IL-1β組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

2.4 IL-1β+IL-6+IL-23組 在基礎培養(yǎng)劑條件下將IL-1β、IL-6、IL-23同時加入后共培養(yǎng),PBC患者初始T細胞分化為Th17細胞效果達到最佳,明顯高于其它各組,差異有顯著性差異(P＜0.01,見表1),PBC患者4組培養(yǎng)條件下Th17細胞分化FCM結果見圖1。

圖1 細胞因子對PBC患者初始T細胞分化為Th17細胞的誘導作用Fig.1 The effectiveness of different cytokines induce Na ?ve T cells of PBC patients differentiating into Th17 cells

表1 不同細胞因子組誘導PBC患者Th17細胞分化[M(Q),n=15]Tab.1 The frequency of Th17 cells differentiation in PBC patients induced by different cytokines[M(Q),n=15]

表2 4種誘導條件下兩組Th17細胞分化頻率比較(M(Q),正常人n=20,PBC n=15)Tab.2 The frequency of Th17 cells differentiation between PBCpatients and normol induced under 4 conditions[M(Q),Normal n=20,PBC n=15]

2.5 PBC患者與正常人Th17細胞分化的差異PBC患者與正常人初始T細胞在相同條件下分組進行培養(yǎng)后,FCM檢測,經(jīng)CXP軟件分析發(fā)現(xiàn):IL-1β+IL-6+IL-23組促使正常人和PBC患者Th17細胞分化效果均達到最佳,但PBC患者Th17細胞分化效果明顯高于正常人,兩者有顯著性差異(P＜0.01);但兩組人群的 IL-1β組或 IL-1β+IL-6組,其初始T細胞向Th17細胞分化的效果均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05),組間比較見表2。

3 討論

由于IFN-γ在自身免疫疾病發(fā)病高峰期病變部位的高表達,使得分泌IFN-γ的Th1細胞被看作是引起自身免疫性疾病的關鍵因素。后發(fā)現(xiàn)IFN-γ缺陷性小鼠也具有對多種自身免疫疾病高度易感性,推測存在一種Th1以外的效應性T細胞介導了自身免疫疾病[7]。新近發(fā)現(xiàn),有一群以分泌IL-17為特征的,不同于 Th1、Th2的 CD4+T細胞,即 Th17細胞,它由初始T細胞分化而來,并具有獨立的分化和發(fā)育機制[8]。進一步研究發(fā)現(xiàn),Th17細胞的分化受多種細胞因子調控。小鼠體外實驗模型中,TGF-β和IL-6聯(lián)用可誘導Th17分化[9]。也有報道稱細胞因子IL-23能促進人Th17細胞的增殖并維持Th17細胞的活性[5]。

原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種自身免疫性膽汁淤積性肝病,以存在抗線粒體抗體和強烈膽管炎癥反應為特征。與正常人相比,PBC患者肝組織Th17細胞顯著增高,表明發(fā)炎的肝臟細胞微環(huán)境更易誘導Th17細胞的產(chǎn)生[4]。Annunziato等[10]發(fā)現(xiàn)IL-6能誘導Th17細胞分泌IL-17,與PBC發(fā)病密切相關。國外有報道稱Th17細胞分化與多種細胞因子密切相關,特別是IL-1β、IL-6和IL-23等起到十分關鍵作用[5,6]。而細胞因子(IL-1β、IL-6與 IL-23)能否誘導PBC患者Th17細胞的分化,且不同細胞因子刺激下PBC患者Th17細胞分化是否有差異,尚未見報道。因此,我們著手研究PBC患者Th17細胞的分化條件及與正常人Th17細胞分化差異,觀察這些細胞因子對PBC患者初始T細胞向Th17細胞分化的影響,以初步探討Th17細胞分化與PBC疾病的潛在聯(lián)系,為進一步揭示PBC的發(fā)病機理提供實驗依據(jù)。

IL-1β是Th17早期分化關鍵的細胞因子,是Th17細胞及Th17細胞介導的自身免疫早期編程的關鍵T細胞信號[6]。本研究中,我們采用免疫磁珠分選技術(MACS)從PBC患者和正常人外周血中分選出初始T細胞,培養(yǎng)時各孔均加入T細胞分化抗體anti-CD3、anti-CD28和中和抗體anti-IL-4、anti-IFN-γ(阻斷初始T細胞向Th1、Th2分化),并在加入不同細胞因子的條件下分組培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)未加入細胞因子的空白對照組Th17細胞分化頻率很低(＜1%);而IL-1β組Th17細胞的分化頻率明顯增高,說明IL-1β顯著促進Th17細胞的分化;與IL-1β組相比,IL-1β+IL-6組Th17細胞分化效果無統(tǒng)計學差異(P＞0.05),我們推測在誘導Th17細胞分化時,IL-6并未起到關鍵的作用。

IL-23對Th17細胞分化的影響,是近年來研究熱點。但它在Th17細胞分化中的作用迄今尚未明確。IL-23是IL-12異二聚體細胞因子家族中的一員,除與IL-12一樣擁有共同p40亞單元外還含獨特的p19亞單元,IL-23通過IL-12Rβ1和IL-23R異二聚體受體復合物來發(fā)送信號。O'Donnell等[11]研究發(fā)現(xiàn),IL-23可誘導Thl7細胞分化并分泌IL-17,在小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)發(fā)病過程中起著重要作用。有研究稱IL-23可能與Th17細胞增殖有關,并能為已分化的Th17細胞提供生存信號[8]。為探討IL-23對Th17細胞分化的影響,我們將IL-1β、IL-6、IL-23一同加入培養(yǎng)液中,發(fā)現(xiàn)此組Th17細胞分化頻率明顯高于其他各組(P＜0.01),表明初始T細胞分化過程中,IL-23可能直接誘導Th17細胞分化,或在維持Th17細胞增殖中起重要作用,這與國外報道一致[4]。

我們將PBC患者與正常人的Th17細胞分化差異進行比較發(fā)現(xiàn),IL-1β、IL-6聯(lián)用或單獨IL-1β誘導時,PBC患者與正常人Th17細胞分化無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05),而在同時加入IL-1β、IL-6、IL-23誘導時,兩者有顯著性差異(P＜0.01)。研究還發(fā)現(xiàn),與單獨 IL-1β 或聯(lián)用 IL-1β、IL-6 相比,IL-1β 、IL-6、IL-23 共同誘導時,無論是PBC患者還是正常人,其初始T細胞向Th17細胞分化效果均能達到最佳。且此時PBC患者Th17細胞分化效率明顯高于正常人(P＜0.01)。

目前,關于PBC患者體內Th17細胞的過度增殖的確切機制尚不清楚。PBC作為一種自身免疫性肝病,是否其免疫異常可能是初始T細胞分化傾向發(fā)生改變,或者可能是PBC患者初始T細胞與正常人相比在基因上存在差別,還有待進一步的研究。我們期冀通過對PBC患者初始T細胞向Th17細胞分化誘導條件的研究,能為進一步探索Th17細胞和揭示PBC發(fā)病機制等的研究產(chǎn)生積極的作用。

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